=”45″>50 2-1  انتخاب رت ………………………………………………………………. 50 2-2 جدا سازی وتكثير سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان ………………………………….. 52 2-2-1 اجرای پاساژ ……………………………… 54 2-3 اثبات مزانشیم بودن سلول های استخراج شده ………………………………………. 54 2-3-1 تمایز به استخوان ……………………………………………………………. 55 2-4 بررسی توان زیستي سلولها (دوز فايندينگ) ……………………………… 55 2-4-1  رنگ آمیزی تریپان بلو ……………………………………………….. 57 2-4-2  سنجش تترازولیوم (MTT) ……………………………………………………. 57 2-4-2-1 مراحل انجام سنجش MTT)غیر استئوژنیک( ………………………………………………………………….. 58 2-4-2-2  ترسیم منحنی استاندارد با استفاده از سنجش تترازولیوم ………………………………………………… 59 2-4-2-3 مراحل انجام تست MTT استئوژنیک ……………………. 60 2-5  انتخاب دوز مورد نظر ……………………………………….. 60 2-6 بررسی توان تکثیری سلول­های بنیادی مزانشیم ……………. 61 2-6-1 سنجش توانایی کلونی­زایی ……………………………… 63 2-6-2 محاسبه تعداد دوبرابرشدگی جمعیتی(PDN) ……………….. 62 2-7 بررسي تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از رنگ آميزي فلوروسنت …………………………………………….. 65 2-8 آزمون­های بیوشیمیایی در شرایط تمایز و غیرتمایزی …………………………………………. 65 2-8-1تیمار و استخراج عصاره سلولی ……………………………… 65 2-8-2 بررسی فعالیت آنزیم­ها ……………………………………… 66 2-8-2-1 تهیه ی نمودار استاندارد برای آزمایش لاوری ……………………………………. 66 2-8-2-2 ترانس آمینازها ………………………………… 68 2-8-2-3 لاکتات دهیدروژناز………………………………… 70 2-8-2-4 آنزیم آلکالین فسفاتاز ……………………………………………… 72 2-8-3 سنجش ميزان رسوب ماتريكس معدني به كمك رنگ آليزارين رد در سلول های استئوژنیک 72 2-8-3-1  رسم منحنی استاندارد برای رنگ آمیزی آلیزارین رد ……………………….. 73 2-8-3-2  بررسی رسوب ماتریکس استخوانی در نمونه های تیمار شده ………………………………… 73 2-8-4  بررسی الکترولیت ها )کلسیم، سدیم و پتاسیم( ……………………. 73 2-8-4-1 بررسی میزان کلسیم داخل سلولی با استفاده از کیت کلسیم به روش رنگ سنجی ………… 74 2-8-4-1-1 مراحل  انجام تست کلسیم در سلول های تمایز یافته )استئوبلاست( ………………………….. 75 2-8-4-1-2 مراحل انجام اندازه­گیری میزان کلسیم ….. 76 2-8-4-2 اندازه­گیری غلظت سدیم و پتاسیم سلول استئوژنیک و غیر استئوژنیک ………………………….. 81 2-9 تجزیه و تحلیل آماری داده ها ………….. فصل سوم: نتایج 82 3-1 الف: نتایج مرحله اول ………………………………… 82 3-1-1  رشد و تکثیر سلولهای بنیادی مزانشیم …………………… 82 3-1-2  اثر اسید بوریک بر توانایی زیستی سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت …………………… 85 3-1-3  بررسی مورفولوژی سلولهای تیمار شده ……………… 87 3-1-4  نتایج توانایی کلونی زایی، تعداد دوبرابر شدگی جمعیت سلول …………………………………………….. 89 3-1-5  اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی …… 91 3-1-6  میزان الکترولیتها………………………………………….. 92 3-2  نتایج اثر دوزهای انتخابی اسید بوریک بر شاخص های تمایز به استئوبلاست ………………………….. 92 3-2-1 توانایی زیستی سلولها در روند تمایز ……………………….. 93 3-2-2 بررسی تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از رنگ­آمیزی فلورسنت در نمونه­های  استئوژنیک 96 3-2-3 بررسی اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی سلولهای تمایز یافته ……………………………….. 97 3-2-3-1  میزان معدنی شدن ماتریکس با سنجش رنگ آلیزارین رد ……………………………………………….. 100 3-2-3-2  میزان رسوب کلسیم …………………………………….. 101 3-2-3-3  بررسی فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز …………. 101 3-2-3-2 بررسی فعالیت آنزیم آسپارتات و آلانین ترانس آمیناز ……………………………………………………….. 103 3-2-3-5  بررسی فعالیت لاکتات دهیدروژناز ……………….. 103 3-2-3-6  بررسی سطح الکترولیت های سلولهای استئوژنیک ……………………………………………  

  فصل چهارم: بحث و نتیجه­گیری 105 4-3 اثر اسیدبوریک بر سلولهای مزانشیم ……………………….. 105 4-1-1اثر اسید بوریک بر توانایی زیستی و توان تکثیر سلولها …………………………………………………… 108 4-1-2 بررسی تاثیر اسید بوریک بر تغییرات مورفولوژیکی ………………………………………………………………… 109 4-1-3 اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی …. 113 4-1-4  اثر اسید بوریک بر فعالیت آنزیمهای متابولیکی ……………………………………… 116 4-2  اثر اسیدبوریک بر تمایز سلولی ……………………………… 116 4-2-1 توانایی زیستی ……………………………………. 119 4-2-2 بررسی سطح الکترولیت ها ……………………………………………. 120 4-2-3  بررسی فاکتورهای استئوژنیک ……………………. 124 4-2-4  بررسی اثر اسید بوریک بر آنزیم های متابولیکی ………….. 127 4-2-5  تاثیر اسید بوریک بر مورفولوژی سلولهای تمایزی …………………………………………….. 128 4-3  نتیجه گیری ……………………………………………………… 129 4-4 پیشنهادات ……………………………………………………………. فصل پنجم:ضمیمه 131 5-1 روش تهیه محیط کشت …………………………………………………. 131 5-2  تهیه ی فسفات بافر سالین PBS ……………………………. 132 5-3 تهیه ی فسفات بافر سالین مثبت PBS+……………………… 132 5-4 روش تهیه محیط تمایزی استئوژنیک ………………………….. 133 5-5  آماده سازی آلیزارین رد …………………………………………… 133 5-6  روش تهیه محلول تریپان­بلو 4/0 درصد ……………………………. 133 5-7  تهیه کریستال ویولت ……………………………………… 133 5-8 روش تهیه محلول   MTT…………………………………. 133 5-9  روش تهیه بافر شست و شو(  ( Tris-Hcl-NaCl………………….. 133 5-10 مواد لازم و روش تهیه بافر  استخراج ( Tris-Hcl) ………… 134 5-11 روش تهیه بافر ARS ………………. 134 5-12 روش تهیه محلول BSA …………………………… 134 5-13   روش تهیه محلول کمپلکس لاوری ………… 135 5-14  روش تهیه بافر استخراج کلسیم …………………………. 135 5-15 روش تهیه رنگ های فلورسنس هوخست و آکریدین اورنژ ….

تعریف سلول­های بنیادی

   به طور نرمال سلول­های تخصص یافته بدن مثل سلول پوست یا سلول عصبی در تمام دوره زندگی به همان صورت باقی می­مانند، اما در بدن سلول­های دیگری به نام سلول­های بنیادی وجود دارند که توانایی تبدیل به سلول­های دیگری چون سلول قلب، عصبی، ماهیچه و ……. را دارا می­باشند (1).

سلول­های بنیادی[1] سلول­هایی غیر تخصصی[2] در بدن هستند که قابلیت تمایز به سلول­های تخصص­یافته را با کسب کلیه اعمال سلولی تخصصی دارند. این سلول­ها دارای دو ویژگی اساسی یعنی توانایی تقسیم و تولید سلول­هایی با خواص یکسان (خودنوزایی)[3]و ایجاد انواع سلول­های