………………………………………………………………………………………………49

3-13-1-1-1- مراحل تهیه محیط کشت دودمان سلولی A549…………………………………………………..49

3-13-1-1-2-تجدیدکشت دودمان سلولی A549……………………………………………………………………..50

3-13-1-1-3- شمارش سلول‌ها و بررسی میزان فعالیت سلول…………………………………………………..51

3-13-2- تهیه محلول تریپسین………………………………………………………………………………………………….52

3-14- آزمون MTT………………………………………………………………………………………………………………..53

3-15- شمارش سلول برای انجام آزمونMTT……………………………………………………………………………54

3-16- روش انجام آزمون MTT دراین پژوهش……………………………………………………………………….54

3-17- بررسی ریخت‌شناسی سلول‌ها تیمار شده با عصاره اکتینومیست‌ها……………………………………..55

3-18- شناسایی سویه‌های منتخب اکتینومیست………………………………………………………………………….56

3-18-1- بررسی مورفولوژی میکروسکوپی……………………………………………………………………………. 56

3-18-2- بررسی میسلیوم‌های هوایی و آرایش زنجیره اسپوری……………………………………………………56

3-18-3- بررسی رشد میسلیومی در محیطISP2 broth………………………………………………………………56

3-19-  مطالعه شیمیوتاکسونومی………………………………………………………………………………………………56

3-19-1- تهیه بیومس برای تعیین ایزومر دی آمینوپامیلیک اسید(DAP)……………………………………………56

3-19-2- تعیین ایزومر DAPموجود در دیواره سلولی…………………………………………………………………… 57

3-20- شناسایی توالی نوکلئوتیدی ژن 16S rRNA سویه‌های منتخب…………………………………………….. 58

3-20-1- تهیه محیط کشت Luria Broth(LB)……………………………………………………………………………..58

3-20-2- تهیه زیست توده برای مطالعات فیلوژنتیک……………………………………………………………………..59

3-20-3- استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………………59

3-20-4- تائید بررسی کیفیت استخراج DNA………………………………………………………………………………61

3-20-4-1- تهیه ژل آگاروز……………………………………………………………………………………………………..61

3-20-4-1-1- تهیه بافر(TAE)Tris-Acetate-EDTA………………………………………………………………..61

3-20-5- انجام فرایند واکنش زنجیره پلیمراز(PCR)……………………………………………………………………..62

3-20-5-2- شرایط واکنش PCR………………………………………………………………………………………………62

3-20-5-3- بررسی محصولات PCR………………………………………………………………………………………..63

3-20-5-4- خالص سازی محصولات PCR……………………………………………………………………………….63

3-20-6- تعیین توالی نوکلئوتیدی قطعات تکثیر شده از ژن 16S rRNA………………………………………….63

3-20-7- مقایسه توالی نوکلئوتید ژن 16S rRNA سویه‌های اکتینومایست منتخب…………………………….63

فصل چهارم: نتایج                                                                                                       

4-1- شرایط پیش تخمیر و تخمیر و میزان متابولیت تولید شده توسط40 سویه  اکتینومیست‌ بررسی شده در این پژوهش………………………………………………………………………………………………………………………………65

4-2- نتایج حاصل از تست ارزیابی سمیت متابولیت‌های ثانویه………………………………………………………..68

4-3- نتایج مربوط به بررسی ریخت شناسی سلول‌ها در تست سمیت سلولی………………………………….. 71

4-4- نتایج مربوط به تست سمیت سلولی با روش MTT……………………………………………………………….72

4-5- بررسی ریخت‌شناسی سلول‌ها پس از تیمار با عصاره سویه‌ی اکتینومیست‌های منتخب………………74

4-6- شناسایی اکتینومیست‌های منتخب………………………………………………………………………………………..74

4-6-1- بررسی ریخت شناسی اکتینومیست‌های منتخب…………………………………………………………………74

4-6-2- تعیین ایزومر DAP موجود در دیواره سلولی…………………………………………………………………… 76

4-6-3- بررسی فیلوژنتیکی اکتینومیست‌های منتخب………………………………………………………………………77

4-6-3-1- تائید استخراجDNA اکتینومیست‌های منتخب………………………………………………………………77

4-6-4- تائید استخراج ژن16S rRNA از ژل آگاروز……………………………………………………………………..77

4-6-4-1- نتایج مربوط به توالی خوانی ژن 16S rRNA……………………………………………………………….78

 فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری                                                                                      

 منابع……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 91

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………101

پیوست‌ها………………………………………………………………………………………………………………………….102

فهرست جداول

عنوان                                                                                                                  صفحه

جدول ‏1‑1: میزان شیوع و مرگ و میر ناشی از انواع سرطان در هر دو جنس زن ومرد. 25

جدول ‏1‑2: تغییرات تنوع سرطان در ایران در طی سال‌های 1376-1318.. 27

جدول ‏1‑3:گروه‌های مختلف اکتینومیست‌ها 29

جدول ‏1‑4: تعدادی از متابولیت‌های استخراج شده توسط اکتینومیست‌ها 32

جدول ‏3‑1:مواد شیمایی استفاده شده 39

جدول ‏3‑2:دستگاه‌های استفاده شده 42

جدول ‏3‑3:ترکیبات محیط کشت ISP2 اصلاح شده 44

جدول ‏3‑4:ترکیبات محیط پیش تخمیر. 45

جدول ‏3‑5:نمک‌های مورد نیاز برای تهیه آب نمک دریایی مصنوعی.. 46

جدول ‏3‑6:ترکیبات مورد استفاده درتهیه محیط کشت دودمان A549. 49

جدول ‏3‑7:ترکیبات محیط کشت… 58

جدول ‏4‑1:نتایج حاصل از مرحله ی تولید واستخراج متابولیت‌های ثانویه. 64

جدول ‏4‑2:درصد کشندگی در عصاره‌ها با محدوده اثری بین 40-59% (محدوده اثر خوب). 67

جدول ‏4‑3:درصد کشندگی در عصاره‌ها با محدوده اثری بین 39-20% (محدوده اثر متوسط). 69

جدول ‏4‑4:درصد کشندگی در عصاره‌ها با محدوده اثری بین 0-19% (محدوده اثرضعیف). 70

جدول ‏4‑5: نتایج مربوط به بررسی مرفولوژی سلول پس از تیمار با عصاره‌ها 70

جدول ‏4‑6: نتایج مربوط به مقایسه مقدار جذب بین عصاره‌ها با شاهد…………………………………………….. 72

جدول ‏4‑7: شماره دسترسی در Gene Bank ومیزان تشابه اکتینومیست‌های منتخب با اکتینومیست‌های ثبت شده براساس ترادف نوکلئوتید‌های ژن 16S rRNAدر ژنوم…………………………………………………………… 80

فهرست نمودارها

عنوان