……………………………………………………………………………………………70

3-1-جمع آوری نمونه ها …………………………………………………………………………………………………………………..71

3-2-مواد و تجهیزات مورد نیاز……………………………………………………………………………………………………………71

3_2_1_ مواد مصرفی…………………………………………………………………………………………………………………………71

3_2_2_تجهیزات مورد نیاز ………………………………………………………………………………………………………………..73

3_2_2_2 _تجهیزات مورد نیاز برای استخراج DNA…………………………………………………………………………….73

3_2_2_3_ تجهیزات برای PCR…………………………………………………………………………………………………………73

3_2_2_4_ تجهیزات برای هضم آنزیمی………………………………………………………………………………………………74

3_2_2_5_ تجهیزات الکتروفورز DNA و ساترن بلاتینگ……………………………………………………………………..74

3_2_2_6_ تجهیزات هیبریداسیون………………………………………………………………………………………………………74

3_2_2_7_ تجهیزات آشکار سازی………………………………………………………………………………………………………74

3_2_2_8_ تجهیزات مورد نیاز برای نانودراپ………………………………………………………………………………………74

موارد روش تحقیق …………………………………………………………………………………………………………………………….74

3_3_13_4_1_تهیه گسترش از نمونه و رنگ آمیزی……………………………………………………………………………..74

3_4_1_3_تفسير نتايج گسترش…………………………………………………………………………………………………………..76

3_4_ 2_کشت نمونه ها……………………………………………………………………………………………………………………..76

3_4_2_ 1_صلایه کردن نمونه ها ………………………………………………………………………………………………….76

3_4_2_2_ آلودگی زدایی و هموژنیزاسیون ……………………………………………………………………………………..76

3_4_2_3_سانتریفیوژ و خنثی سازی PH……………………………………………………………………………………… 78

3_4_2_4_ کشت در لوله های لونشتاین – جانسون حاوی گلیسیرین و پیرووات……………………………….79

3_4_3_بررسی کشت لوله های لونشتاین – جانسون  ………………………………………………………………………80

3_4_4_  رنگ آمیزی به روش فلئورو کروم …………………………………………………………………………………. 80

3_4_5_ انجام تست های بیوشیمیایی تعیین هویت ………………………………………………………………………….81

3_4_5_1_تست نیاسین ……………………………………………………………………………………………………………….82

3_4_5_2_ تست کاتالاز ……………………………………………………………………………………………………………. 82

3_4_ 6_کشت مجدد در لوله لونشتاین – جانسون…………………………………………………………………………….82

3_4_7_استخراجDNA ………………………………………………………………………………………………………………..83

3_4_7_1_آماده سازی مواد مصرفی برای استخراج DNA……………………………………………………………… 83

3_4_7_2_ كنترل و جمع آوري سلولهاي باكتري رشد يافته ……………………………………………………………..83

3_4_7_3_مراحل استخراج DNA ………………………………………………………………………………………………..84

3_4_8_ارزيابي كيفيت و کمیتDNAاستخراج شده………………………………………………………………………….86

3_4_8_1_ارزيابي كفيت DNA استخراج شده………………………………………………………………………………..86

3_4_8_1_1_آماده سازی مواد مصرفی  جهت  ارزیابی کیفی DNA استخراج شده…………………………….86

بافر تریس-بورات-EDTA یک برابر……………………………………………………………………………………………….86

بافر نمونه………………………………………………………………………………………………………………………………………86

ژل آگارز……………………………………………………………………………………………………………………………………….86

3_4_8_2_ارزیابی کمیت DNA استخراج شده برای انجام PCR و RFLP……………………………………… 88

3_4_8_3_ PCR بر اساس پروتکل WHO………………………………………………………………………………….. 90

3-4-8-3-1مراحل PCR روی نمونه های DNA استخراج شده………………………………………………………..91

3-4-9- الكتروفورز محصولPCR……………………………………………………………………………………………….. 92

RFLP …………………………………………………………………………………………………………………………………………92

3_4_10_هضم DNA  کروموزمی به وسیله آنزیم Pvu II………………………………………………………………. 93

3_4_11_جداسازی قطعاتDNA به وسیله الکتروفورز……………………………………………………………………..94

3_4_12_ ساترن بلاتینگ ………………………………………………………………………………………………………………94

3_4_12_1_آماده سازی محلول های مورد نیاز ساترن بلاتینگ …………………………………………………………94

3_4_12_2_عمل آوری ژل قبل از بلاتینگ ……………………………………………………………………………………..96

3_4_12_3_بلاتینگ به روش موئینه ……………………………………………………………………………………………….96

3_4_12_3_عمل آوری غشا بعد از بلاتینگ ……………………………………………………………………………………97

3_4_13_تثبیت DNA برروی غشا ………………………………………………………………………………………………..98

3_4_14_تهیه پروب های هیبریداسیون و مک هیبریداسیون …………………………………………………………………..98

3_4_14_1_پروب PGRS ………………………………………………………………………………………………………………..99

3_4_14_2_به دست آوردن رقت مناسب براي پروبPGRS  به روش مک هیبریداسیون………………………..99

3_4_15_شناسایی ……………………………………………………………………………………………………………………………100

3_4_16_دات بلاتینگ ……………………………………………………………………………………………………………………..101

3_4_17_پری هیبریداسیون و هیبریداسیون با پروب نشان دار با دیگوکسیژنین ……………………………………..102

3_4_17_1_مرحله پری هیبریداسیون ………………………………………………………………………………………………..102

3-4-17-2- مرحله هیبیریداسیون ………………………………………………………………………………………………………102

فصل چهارم(نتایج و بحث ) …………………………………………………………………………………………………………….104

نتایج و بحث ……………………………………………………………………………………………………………………………………105

4-1- نمونه برداری ………………………………………………………………………………………………………………………….105

4-2- بررسي كشت لوله هاي لونشتاين– جانسون ………………………………………………………………………………..105

4-3-آزمون وجود IS6110 ………………………………………………………………………………………………………………106

4-3-1- نتايج واكنش