………………..77

3-2-18- 3-محلولها و ترکیبات  ………………………………………….77

3-2-18- 4-تهیه‌ی محلول‌های استاندارد ریبوز  ………………………………………………………………………..77

3-2-18- 5- آماده سازی PRP تخلیص شده  ……………………………………………………………………………….79

3-3-1- آزمون هاي پروتئين سنجي ……………………………………………………………………………………………….79

3-3-2روش برادفورد …………………………………………………………………………………..81

3-3-3- روش پروتئين سنجي  Lowry ………………………………………………………………81

3-4-1- آزمون ایمونو ژل دیفیوژن  ………………………………………………………………….83

3-5- سنجش نوکلئیک اسید …………………………………………………………………………………………………….83

3-6-تخلیص اگزوتوسین A سودوموناس آئروژينوزا PA103   …………………………………………………………………….84

3-6-1- طرز باز كردن سوش ليوفيليزه جديد …………………………………………………………………………..84

3-6-2-تهيه لوله بذر ……………………………………………………………………………………….84

3-6-3- اطمینان از خالص بودن سوش …………………………………………………………………………..85

3-6-4- تست سوش برای تولید اگزوتوکسین A ………………………………………………………………………………………………..85

3-6-5-تهیه محیط کشت ………………………………………………………………………85

3-6-7- رسوب با استات روی 1 مولار ………………………………………………………….87

3-6-8- رسوب با سولفات آمونيوم …………………………………………………………………………………………..87

3-6-9- دياليز اگزوتوكسين   A …………………………………………………………………………….88

3-6-10- کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل اگزوتوكسين  A   ………………………………………………………………………………..89

3-16-2-1مواد مورد نیاز: ………………………………………………………………………89

3-6-11سنجش توليد اگزوتوكسين  ………………………………………………………..89

3-6-11-1-سنجش توکسیسیتی  ……………………………………………………………………………….90

3-6-12- دتوكسيفاي كردن اگزوتوكسين A  به روش فرمآلدیئد  ……………………………………………………………………………91

3-7- ژل فيلتراسيون جهت تخليص كونژوگه PRP هموفیلوس آنفولانزای تیپb  (Hib) با اگزو توکسین A سودوموناس آئروژینوزا …………………..92

3-8- آزمون های کنترل و کیفی کونژوگه …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….92

3-9- سنجش پروتئین  …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………92

3-11- تعیین میزان اسید نوکلئیک  …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..93

3-12- كنترل توكسيسيته غیرعادی((Abnormal toxicity ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………94

3-13- آزمون پیروژنی  ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….94

3-14- ایمیونیزاسیون خرگوشها و خونگیری  …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………94

3-15تهیه بافر باربیتال : ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..94

3-16- تهیه محلول کوماسی بلو و رنگ بر : ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….94

3-16- پلي آكريل آميد ژل الكتروفورز درحضور سديم دو دسيل سولفات(SDS-PAGE)  ………………………………………………………..96

3-16-1- اصول روش SDS-PAGE  …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….96

3-16-3- محلول­هاي مورد نياز ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….97

3-16-4- تهیه ژل پایین SDS-PAGE ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….97

3-16-5- تهیه ژل بالا با SDS-PAGE …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………98

3-16-6-رنگ آميزي ژل پلي آكريل آميد  ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………99

3-16-7- محلول­هاي مورد نياز  ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………100

3-16-8- روش رنگ آميزي  …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………101

3-17- آزمون بررسی فعالیت باکتریسیدالی سرم حیوان ایمیون (SBA[1]) ………………………………………………………………………………………………………………………………….101

3-17-1- اصول آزمون SBA  ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….101

3-17-2- مواد مورد نیاز برای آزمون SBA Serum Bactericidal Assay)) …………………………..101

3-17-3-روش انجام آزمون