شکیل­دهنده محلول برادفورد 85 3-5: مواد تشکیل­دهنده Running Buffer 10% 86 3-6: مواد تشکیل­دهنده Coomassie Gel stain 87 3-7: مواد تشکیل­دهنده Coomassie Gel Destain 87 3-8: مواد تشکیل­دهنده Fixation solution 87 3-9: مواد تشکیل­دهنده Stainining solution 88 3-10: مواد تشکیل­دهنده ژل 10%,12.5%   Separating 89 3-11: مواد تشکیل­دهنده ژل  Stacking 5% 89 4-1: درصد نمونه­های بالینی 93 4-2: نتایج تست­های بیوشیمیایی 96 4-3: نتایج تست­های حساسیت آنتی­بیوتیکی و  TCH 97 فهرست تصاویر 2-1: استخوان سـتون فقرات بدشـکل در مومیایی، به­دلیل بیماری سـل 11 2-2: عکس­برداری توسط میکروسکوپ الکترونی از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس 16 2-3: کلنی­های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس روی محیط لونشتاین جانسون 17 2-4: نمای شماتیک ازساختمان دیواره مایکوباکتریوم توبرکلوزیس 22 2-5: میزان بروز مایکوباکتریوم توبرکلوزیس درنقاط مختلف جهان در سال 2012 40 2-6: درخت تبارشناسی زیرسویه­های مختلف BCG M. bovis بر اساس اطلاعات پراکندگی آن­ها و خصوصیات مولکولی 46 2-7: برخی از عکس­های تاریخی مربوط به کاشفان واکسن ب ث ژ 49 3-1: مرحله دیالیز 84 3-2: آماده­سازی صفحات شیشه­ای 88 4-1: باسیل اسید فست در رنگ امیزی اورامین 93 4-2: باسیل اسید فست در رنگ امیزی ذیل-نلسون 94 4-3: فاکتور طنابی (cord factor) 95 4-4: تفسیر تست نیترات 95 4-5: باندهای پروتئین­های غشایی سویه­های M. bovis و M. TB ، استخراج پروتئین به روش آمونیوم سولفات، ژل 10% و رنگ آمیزی آمیزی کوماسی بلو R-250 99 4-6: باندهای پروتئین­های غشایی سویه­های M. bovis و M. TB ، استخراج پروتئین به روش آمونیوم سولفات، ژل 10%  رنگ آمیزی Blue Silver Staining 100 4-7: باندهای پروتئین­های ترشحی سویه­های M. bovis و M. TB 101 5-1: تصویر A سویهM. tuberculosis H37Rv  و تصویرB سویه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس 106  

 

چکیده

مایکوباکتریوم توبرکلوزیس عامل بیماری سل می­باشد. از زمانی که سازمان جهانی بهداشت در سال 1993، توبرکلوزیس را به عنوان یک فوریت اعلام نمود، تا کنون کنترل آن به دلیل وجود سوش­های مقاوم به درمان و تداخل با بیماری ایدز دچار مشکل شده است. مايکوباکتريوم بوويس به عنوان عامل سل گاوي به صورت موردي انسان را نيز درگير مي کند و به عنوان یکی از معضلات بهداشتی با گستره جهانی محسوب می­شود. مبارزه با این آلودگی امروزه باعث گسترش بررسی آنتی­ژن­های باکتری به منظور دسترسی بیومارکرهای موثر در تشخیص، اهداف دارویی و اجزای واکسن مورد اهمیت واقع شده­­اند.

جهت مقایسه پروفایل پروتئینی سویه­های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس به درمان و مایکوباکتریوم بوویس از کل نمونه­های ارسالی 6 ماهه اول سال 1392 به بخش مایکوباکتریولوژی انسیتو پاستور، 100 نمونه مورد ارزیابی قرار گرفت. در ابتدا نمونه­های کلینیکی با روش ان استیل- ال سیستئین- هیدروکسید سدیم و در محیط کشت لونشتاین جانسون کشت داده شد و جهت افتراق مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس و مایکوباکتریوم بوویس از سایر مایکوباکتریوم­ها، از تستهای بیوشیمیایی (نیترات، کاتالاز، نیاسین و TCH) و حساسیت آنتی بیوتیکی استفاده شد. کلونی­ها در محیط میدل بروک 7H9 کشت داده شد، پس از برداشت کلونی­های جدید، به منظور استخراج پروتئین­های ترشحی و غشایی از روشهای سونیکاسیون، رسوب دهی با سولفات آمونیوم و الکل استفاده گردید و به وسیله روش برادفورد تعیین غلظت شد  و در نهایت مقایسه با روش الکتروفورز تک بعدی انجام پذیرفت.

با بررسی باندهای حاصله از پروتئین­های غشایی و ترشحی در 5 سویه کلینیکی متفاوت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس هیچگونه تفاوتی مشاهده نشد و همچنین در 5 سویه کلینیکی متفاوت مایکوباکتریوم بوویس نیز تفاوتی مشاهده نشد. در سویه­های مایکوباکتریوم بوویس، برای پروتئین­های غشایی باندهایی در محدوده 15 تا 85 کیلودالتون مشاهده شد و در سویه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس نیز باندهای از 15 تا 120 کیلودالتون مشاهده شد این دو سویه در محدوده­های وزنی تقریبا 30 تا 116 کیلو دالتون بسیار متفاوت بوده­اند.

در بررسی پروتئین­های ترشحی در سویه­های مایکوباکتریوم بوویس، باندهایی در محدوده 15 تا 115 کیلودالتون و در سویه­های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس باندهایی از 18 تا 114 کیلودالتون مشاهده شدند که اختلافات وزنی کمی در این محدوده­ها مشاهده شد.

نتایج حاصل از تفکیک باندهای پروتئینی سویه­های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس، حاکی از شباهت نسبی با سویه استانداردM. tuberculosis H37Rv  نسبت به مطالعات دیگر است. اختلافات مشاهده شده در باندهای حاصله از هر دو نوع پروتئین­های سویه­های مایکوباکتریوم بوویس و مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس می­تواند مرجعی برای بررسی­های بیشتر پروتئومیکس در باکتری مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس و بوویس باشد.

به نظر می­رسد اختلاف بیان باندهای پروتئینی سویه­های حساس و بوویس با به کارگیری روشهای مناسب می­تواند به عنوان پروتئین مارکر و یا حتی بیومارکر موثر در تشخیص سویه­های حساس و بوویس از یکدیگر، اهداف دارویی و اجزای واکسن قابل استفاده باشد.                       

فصل اول

مقدمه

1-1. کلیات سل

سل بیماری است که از دیرباز در بین جوامع مختلف شیوع داشته است و عامل آن را از اسکلت انسان­های عصر حجر و استخوان­های مومیایی شده مصریان باستان جدا کرده­اند .(Zink A R. et al., 2003) امروزه يكي از بزرگترين مسائل بهداشتي جهان، بيماري سل است. حدس زده ميشود كه از هر سه نفر جمعيت جهان، يك نفر به باسيل سل آلوده بوده و درهر ثانيه يك نفر به تعداد آنان افزوده مي­شود. نگران كننده اين است كه طبق برآوردهاي موجود 50 ميليون نفر از اين افراد، به باسيل سل مقاوم به چند دارو (MDR-TB) آلوده هستند. درحال حاضر 12 ميليون نفر درجهان به بيماري سل مبتلا هستند كه بيش از 80% اين موارد، تنها مربوط به 22 كشور درحال توسعه جهان است.

در سال 2010 میلادی، حدود 8/8 ميليون نفر جدید به سل فعال مبتلا شده و حدود 1/1 ميليون نفر در اثر اين بيماري جان مي­سپارند. بيش از 90% موارد بيماري و مرگ ناشي از سل در كشورهاي در حال توسعه رخ مي­دهد، كشورهايي كه 75% موارد بيماري در آنها به فعال­ترين گروه سني به لحاظ اقتصادي (يعني 15 تا 54 سالگي) تعلق دارد.

آلودگي هم­زمان به ويروس ايدز خطر ابتلا به بيماري سل را به طور معنا داري افزايش مي­دهد. كشورهاي با شيوع بالاي HIV، به ویژه كشورهاي واقع در افريقاي زير صحرا، شاهد افزايش چشمگير تعداد بيماران مبتلا به سل و افزايش 2 تا 3 برابر ميزان­هاي بروز گزارش شده سل در دهه 90 بوده­اند. در سال 2010، میزان شیوع عفونت اچ آی وی در میان بیماران مبتلا به سل در جهان 13% تخمین زده شده است (W.H.O., 2010).

سل یک بیماری تنفسی است که راه عمده سرایت آن ذرات تنفسی[1] وخلط سینه بیماران[2] می­باشد. اما  روش­های