زی باکتری شایسته…………………………………………………………………………………………………………………………..30

3-4-1-1 مواد و محلول ها…………………………………………………………………………………………………………………………………….30

3-4-1-2 روش کار………………………………………………………………………………………………………………………………………………30

3-4-2 ترانسفورماسیون پلاسمید به سلول های مستعد TOP10  E.coli.. ………………………………………………………………..31

 3-4-2-1 روش کار……………………………………………………………………………………………………………………………………………..31

3-4-3 ارزیابی کلونی ها………………………………………………………………………………………………………………………………………..32

3-4-4 استخراج پلاسمید – AMP+ pBSK  حاوی DNA ناحیه C2……………………………………………………………………..33

3-4-5 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده……………………………………………………………………………………………………………..35

3-4-5-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion…………………………………………………………………………………………..35

3-4-5-2 الکتروفورز…………………………………………………………………………………………………………………………………………….35

3-5 ساب کلونینگ ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM……………………………………………………………………………………………….37

3-5-1 تخلیص DNA ناحیهC2  از ژل………………………………………………………………………………………………………………….37

3-5-2 لایگیشن…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….38

3-5-3 ترانسفورماسیون………………………………………………………………………………………………………………………………………….39

3-5-3-1 آماده سازی سلول های شایسته…………………………………………………………………………………………………………………39

3-5-3-2 ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coli BL21(DE3) با محصول لایگیشن…………………………………………40

3-5-4 ارزیابی کلونی ها………………………………………………………………………………………………………………………………………..40

3-5-5 استخراج پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM……………………………………………………..41

3-5-6 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده……………………………………………………………………………………………………………..42

3-6  بیان پروتئین مولتی توپ EpCAM………………………………………………………………………………………………………………..43

3-6-1 القاء بیان پروتئین………………………………………………………………………………………………………………………………………..43

3-6-2 بررسی بیان به کمک تکنیک SDS-page…………………………………………………………………………………………………….43

3-6-2-1 روش ساخت محلول ها و ژل ها……………………………………………………………………………………………………………..44

3-6-2-2 Run  کردن نمونه ها……………………………………………………………………………………………………………………………..45

3-6-2-3 رنگ آمیزی با کوماسی G-250 کلوئیدی………………………………………………………………………………………………….45

فصل چهارم:نتایج

4-1 نتایج حاصل از بهینه سازی توالی ………………………………………………………………………………………………………………………….47

C2ناحیهDNA4-2 سنتز شیمیایی………………………………………………………………………………………………….50

4-3کلونینگ پلاسمید AMP+ -pBSK حاویDNA ناحیهC2…………………………………………………………………………………….52

4-4 ساب کلونینگ ژن ناحیه C2……………………………………………………………………………………………………………………………….54

4-5بیان پروتئینC2 و تایید آن به کمک تکنیک SDS_page…………………………………………………………………………………………..57

فصل پنجم:

بحث…………………………………………………………………………………………………………………………59

نتیجه گیری………………………………………………………………………………………………………………………………..69

منابع…………………………………………………………………………………………………………………………………………71

چکیده انگلیسی………………………………………………………………………………………………………………………………..74

فهرست شکل ها:

شکل 1-1 تصویر بخش های مختلف روده بزرگ………………………………………………………………………………………………………5

شکل1-2 نمای کلی روده بزرگ، روده کوچک و معده……………………………………………………………………………………………….6

شکل1-3 درصد فراوانی محل آناتومیک سرطان کولورکتال ………………………………………………………………………………………..7

شکل1-4 درصد فراوانی مراحل سرطان کولورکتال…………………………………………………………………………………………………..12

شکل1-5 نقشه ژنتیکی پروتئین ALCAM…………………………………………………………………………………………………………….15

شکل1-6 رنگ آمیزی ایمنوهیستوشیمیایی ALCAM در بافت توموری…………………………………………………………………….17

شکل3-1 نقشه ژنی پلاسمید Pet28a…………………………………………………………………………………………………………………….24

شکل3-2 دستگاه انکوباتور……………………………………………………………………………………………………………………………………25

شکل3-3 دستگاه اتوکلاو………………………………………………………………………………………………………………………………………26

شکل3-4 دستگاه مولد ولتاژو تانک الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………..26

شکل3-5 شیکر انکی باتور…………………………………………………………………………………………………………………………………….27

شکل3-6 سانتریفیوژ……………………………………………………………………………………………………………………………………………..27

شکل3-7 دستگاه تصویر ساز ژل……………………………………………………………………………………………………………………………27

شکل3-8 ترموسایکلر……………………………………………………………………………………………………………………………………………28

شکل3-9 بن ماری ………………………………………………………………………………………………………………………………………………28

شکل3-10 کیت استخراج پلاسمید…………………………………………………………………………………………………………………………33

شکل3-11 کیت استخراج DNA از ژل فرمانتاز………………………………………………………………………………………………………37

شکل4-1 شاخص سازی کدون. سمت راست: قبل از بهینه سازی سمت چپ: بعد از بهینه سازی…………………………………..48

شکل4-2 میزان فراوانی کدون های بهینه. سمت چپ: قبل از بهینه سازی سمت راست:بعد از بهینه سازی ……………………..48

شکل4-3 شاخص سازی محتوای G-C سمت راست:قبل از بهینه سازی سمت چپ: بعد از بهینه سازی………………………..49