های پروتئین های کپسیدی L1 وL2، از نظر قابل دسترس ترین  اپی توپ ها با توجه به طراحی سه بعدی آن ها، در نظر گرفتن نواحی N گلیکوزیله شده، هیدروفیلیسیته و آنتی ژنسیته، بهترین اپی توپ ها شامل بیست اپی توپ بیست  اسید آمینه ای انتخاب و پس از آنالیزهای مثبت، ساختار نهایی مشتمل بر چهارصد اسید آمینه به صورت DNA طراحی  شد و به صورت 1200 نوکلئوتید ترجمه معکوس گردید، سپس در جهت بهترین بیان در E.coli بهینه سازی شد. آنزیم های برش گر BamHI و HindIII به ابتدا و انتهای توالی اضافه و سپس در غالب یک ساختار ژنی در کنار یکدیگر قرار داده شد. ژن طراحی شده مذکور ، توسط شرکت بیوماتیک سنتز شده و در پلاسمید pET28a کلون گردید. پس از دریافت پلاسمید مذکور، در سلول های E.coli BL21DE3 ترانسفرم گردید. بیان پلاسمید نوترکیب در سلول های باکتری با اضافه نمودن 1میلی مولار IPTG در طول 4 ساعت کشت انجام شد و سپس پروتئین توسط ستون کروماتوگرافی   Ni-NTA خالص شد و خلوص با تکنیک SDS-page تائید شد و سپس در برابر آنتی بادی anti-His در وسترن بلات مورد تایید قرار گرفت. جهت بررسی ایمنی زایی، واکسن کاندید همراه با ادجوانت فروند ناقص همراه با گروه کنترل  PBS به گروه هاي موشی  BALB/c (n=6 ) دو بار و به فاصله 2 هفته بصورت زیر پوستی تزریق شدند که میزان تزریق در هر سری 10 میکروگرم بود. یک هفته پس از دومین واکسيناسيون موش ها ،توتال آنتی بادی ها به روش الایزای غیر مستقیم ارزیابی شدند. نتایج نشان داد که واکسن کاندید تولید شده در میزبان باکتریایی و خالص شده به وسیله ی Ni-NTA، یک باند در حدود 45 کیلو دالتون در وسترن بلات نشان داد. همچنین واکسیناسیون با واکسن کاندید یونیورسال بر پایه ی L1/L2 HPVs  منجر به افزایش قابل توجه در پاسخ ایمنی همورال در مقایسه با گروه کنترل شد.

واژه های کلیدی : پاپیلوما ویروس انسانی، پروتئین کپسید L1 و L2 ، چند اپی توپی، یونیورسال واکسن

فصل اول

مقدمه

پاپیلوما ویروس ها، گروهی از ویروس های DNA دار هستند که باعث ایجاد زگیل  یا پاپیلوم در انواعی از مهره داران عالی از جمله انسان ها می شوند. همچنین بعضی از پاپیلوما ویروس ها می توانند در حیوانات و انسان ها بدخیمی ایجاد کنند. تعدادی از پاپیلوما ویروس ها به عنوان عوامل ایجاد کننده سرطان گردن رحم و سایر تومورهای اپی تلیال مطرح شده اند (1). این ویروس ها، ذراتی کروی، کوچک و بدون پوشش با اندازه ای حدود 55 نانومتر هستند که کپسید آنها تقارن بیست وجهی دارد و ژنوم DNA دو رشته ای خطی این ویروس را در بر می گیرد (6،5،4،3،2). این ویروس ها کاملا اختصاصی گونه و بافت می باشند و در سلول های اپی تلیال پوست و مخاط تکثیر می شوند و برای ایجاد عفونت پایا باید سلول های بازال را آلوده کنند (4،1).

علیرغم تنوعی که در پاپیلوماویروس ها وجود دارد، تشابه بسیار زیادی در سکانس پروتئینی و نوکلئوتیدی اعضای خانواده پاپیلوماویروس وجود دارد و ژنوم های مجزا، سازماندهی ژنتیکی مشابهی دارند (7). ژنوم این ویروس ها از 3 ناحیه مجزا تشکیل شده است که شامل ناحیه کنترلی غیر کد کننده ، ناحیه اولیه و ناحیه تاًخیری می باشد. ناحیه کنترلی حاوی توالی های تنظیمی است. ناحیه اولیه شش پروتئین            غیر ساختمانی اولیه E1, E2 E4, ,E5, ,E6 ,E7 و ناحیه تاخیری، دو پروتئین کپسیدی L1 و L2 را          کد دهی  می کند (9،8،1). کپسید ویروس از دو پروتئین ساختمانی تشکیل شده است. پروتئین کپسید اصلی یا L1 دارای وزن مولکولی حدودا 55 کیلو دالتون است که تقریبا 80 درصد کل پروتئین های ویروس را شامل می شود (10). پروتئین کوچک یا L2 تقریبا 70 کیلو دالتون است و در کپسید ویروس جای دارد. ذرات شبه ویروسی یا VLP از پاپیلوما ویروس های مختلف به وسیله بیان ژن L1 به تنهایی یا همراه پروتئین L2 در سیستم های بیان کننده پستانداران و غیرپستانداران تولید شده است (12،11). بیان پروتئین L1 در E.coli باعث تولید ذرات شبه ویروسی کوچک می شود. این ذرات پنتامر 12 تایی بوده و دارای ساختار 20 وجهی هستند. این ذرات شبه ویروسی به خوبی سیستم ایمنی هومورال را تحریک میکنند و بعنوان واکسن پروفیلاکتیک استفاده میشوند (13). پروتئین L2 در تجمع کپسید ویروس نقش دارد و در ضمن دارای اپی توپهای خنثی کننده نیز می باشد. احتمالا وجود پروتئین2 L در واکسن میتواند از طیف گسترده تری از تیپ های ویروسی پیشگیری کند. هرچند که اپی توپ های خنثی کننده آن شبیه به L1 توانایی حفاظت کنندگی را ندارند اما اپی توپ های آن واکنشهای متقاطع را القا می کنند (14،15،16 و 17).

پروتئین های اولیه E1 و E2 برای تکثیر و باقیماندن ژنوم ویروس مورد نیاز می‌باشند. پاپیلوماویروس های انسانی، پروتئین E3 را ندارند. پروتئین E4 از ناحیه اولیه کد می شود اما در مراحل تاًخیری عفونت بیان شده، باعث گریز ویروس از سلولهای آلوده می گردد (4،2). E5 یک پروتئین انکوژن است که رسپتورهای اختصاصی فاکتور رشد را فعال می کند و در ترانسفورمیشن خوش خیم نقش دارد(2). E6 وE7 انکوپروتئین های اصلی پاپیلوماویروس را کد می کنند. انکوپروتئین E6 مانند پروتئین E1B آدنو ویروس تیپ 5 و آنتی ژن T بزرگ ویروس SV40 قادر است به پروتئین  سرکوب کننده تومور پروتئین های P53 و E6 باعث ممانعت از تعمیر DNA آسیب دیده یا ممانعت از القاء مرگ برنامه‌ریزی شده می گردد و در نهایت باعث تجمع جهش های ژنتیکی درسلول‌های آلوده شده و سلول ها  رشد بی رویه ای را آغاز      می کنند و سرانجام به صورت سرطانی در می آیند (18).

بیش از 200 تیپ پاپیلوما ویروس انسانی شناسایی شده است که تفاوت های ژنومی در توالی های DNA دارند (19،5) . پاپیلوماویروس های انسانی قادرند سلول های اپی تلیال بازال پوست و دیواره داخلی     بافت ها را آلوده کنند و بر این اساس به انواع پوستی و مخاطی طبقه بندی می شوند. انواع مخاطی         می توانند دیواره دهان، گلو ، دستگاه تنفس یا اپی تلیوم آنوژنیتال را آلوده نمایند و براساس ارتباط آنها با سرطان گردن رحم و جراحات پیش ساز ، به انواع پر خطر ، با خطرمتوسط و کم خطر تقسیم بندی      شده اند (1، 20 ،21).

تعداد صفحه : 212

قیمت : 14700تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        ———-        [email protected]

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

***  *** ***