…………………………………………………………….  108 شکل (4-5):DNA های مناسب برای انجام RFLP ……………………………………………………………………………  109 تصویر(4_6): قطعات DNA ، هضم شده بوسیله آنزیم محدود کننده Pvu II ………………………………………..  110 تصویر(4-7): RFLP با آنزیم Pvu II و هیبریداسیون با پروب PGRS ………………………………………………….  111 تصویر(4-8):RFLP با آنزیم Pvu II و هیبریداسیون با پروب DR ……………………………………………………….  112

چکیده:

بیماری سل گاوی ناشی از مایکوباکتریوم بویس دربسیاری از کشورها ازجمله ایران شیوع دارد برای کنترل وریشه کنی این بیماری، شناسایی منبع عفونت، مسیر انتقال وحیوانات ناقل الزامی است، که این امربا استفاده از تمایز بین سویه های مختلف مایکوباکتریوم بویس، توسط تکنیک های مولکولی ازجمله RFLP صورت می پذیرد. جهت بهینه سازی وتسریع برنامه ریشه کنی دراین تحقیق، تکنیک RFLP توسط آنزیم Pvu II با استفاه از پروب های PGRS و DR از نظر تنوع الگوی ژنومی وشناسایی بهتر سویه ها مورد مقایسه قرارگرفتند.

در مطالعه حاضر طی سالهای 1388 تا 1390 از 65 نمونه ی مشکوک به سل استان خراسان ارسالی به آزمایشگاه رفرانس مایکوباکتریومهای بیماریزای دام موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، پس از کشت،  تعداد 12مورد اسمیر مثبت شناسایی گردید که پس از استخراج DNA و ارزیابی آنها  تعداد 8 جدایه مناسب RFLP توسط دوتکنیک فوق مورد بررسی قرارگرفتند. جدایه های مورد نظر بر روی محیط کشت لونشتاین جانسون پیرووات دار و گلیسرینه کشت داده شدند. کلیه جدایه ها به روش مولکولی و بیوشیمیایی تعیین هویت گردیدند. از کلنی های مشخص طبق روش ون- سولینگن ، DNA باکتریایی استخراج شد. سپس DNA های مایکوباکتریوم بویس جدایه گاوی توسط آنزیم محدود کننده Pvu II هضم و الگوهای بدست آمده با روش RFLP پس از هیبریداسیون با پروب های PGRS و DR  با یکدیگر مقایسه شدند. در هیبرید سازی با PGRS از 8 سویه مورد مطالعه تعداد 2 الگوی مختلف و پس از هیبرید سازی با DR تعداد 3 الگوی مختلف به دست آمد.

این تحقیق شواهد محکمی براین است که در گاوهای استان خراسان مایکوباکتریوم وجود دارد و احتمال انتقال به انسان و ایجاد بیماري سل حتمی است. لازم به ذکراست که تحقیق حاضر اولین مطالعه مولکولی برروي مایکوباکتریوم در گاوهای استان خراسان می باشد، لذا تعمیم برنامه هاي مبتنی برشناسایی مایکوباکتریومها در سایر استانها براي ردیابی عامل سل درگاوها و ارتباط آن با بیماري سل درانسان ضروري است.

کلید واژه: مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس– تعیین هویت مولکولی – RFLP   PGRS­DR,

فصل اول

 مقدمه  و کلیات

1-مقدمه:

 سل یک بیماری واگیردار است. تقریبا یک سوم جمعیت جهان (یعنی 2 میلیارد نفر) به میکروب سل آلوده و در خطر ابتلا به بیماری قرار دارند و هر ساله حدود 9 میلیون نفر به سل فعال مبتلا شده و حدود 5/1 تا 2 میلیون نفر در اثر این بیماری جان می سپارند. شیوع مجدد بیماری در دو دهه اخیر نشان دهنده درگیر بودن تمام کشورها با مایکوباکتریوم‌ها[1] بوده است. بیش از 90  درصد موارد بیماری و مرگ ناشی از سل در کشورهای در حال توسعه رخ می دهد. با جهانی شدن بیماری مهلک ایدزومساله حائز اهمیت مقاومت چند داروئی که نتیجه مدیریت ضعیف درمان سل است، سازمان بهداشت جهانی(WHO) درمجمع سال 1991 ضمن اعلام بیماری سل به عنوان یک اورژانس جهانی، کاهش هر چه سریع تر میزان شیوع مرگ و میر و به تبع آن میزان بروز سل را در اهداف کلی خود و کشورها قرار داده و سپس با معرفی راهبرد DOTS زمینه کنترل بیماری را بطور نسبی فراهم آورد. در حال حاضر با توجه به داده­های آماری سل یکی از بزرگترین علت مرگ ناشی از بیماریهای عفونی تک عاملی بوده(حتی بیش از ایدز، مالاریا و سرخک) و دارای مرتبه دهم در بار جهانی بیماری هاست و پیش بینی می شود تا سال 2020 همچنان جایگاه کنونی را حفظ کند و یا تا مرتبه هفتم بالا رود. (هاین و کریمر[2]، 2012).

 باسیل این بیماری مایکوباکتریوم توبرکلوزیس یا باسیل کخ نام دارد زیرا که در سال ۱۸۸۲ (میلادی) پرفسور رابرت کخ دانشمند آلمانی آن را کشف کرد. بیماری سل گاوی یکی از قدیمی ترین بیماریهای عفونی مشترک بین انسان و دام است که قدمت آنرا به اندازه حیات بشریت می‌دانند و از گذشته‌های دور مورد شناسایی قرار گرفته است. (سینگ و ورما[3]، 2004).

سل گاوی که عامل آن مایکوباکتریوم بویس می­باشد، یکی از اعضای گروه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس است. این بیماری یکی از مهمترین بیماریهای عفونی خانواده بویده به ویژه گاوها و خانواده کاپرینه به ویژه بزها در سراسر دنیا از جمله ایران می­باشد و سالیانه رقم قابل توجهی را برای پیگیری و ادامه برنامه ریشه‌کنی به خود اختصاص می­دهد. در ایران علیرغم به کارگیری برنامه ریشه کنی سل گاوی با این که شیوع این بیماری در گاوداریهای صنعتی بشدت کاهش پیدا کرده ­است ولی هنوز سل گاوی در دامداری های کشور دیده می‌شود به همین منظور براي كنترل بيماري سل گاوي برنامه هاي ريشه كني و كنترل از سال 1334 مورد اجرا درآمده و نتايج نشان ميدهد كه از17 % به 14/0% كاهش يافته است. علوی (1388) برنامه هاي تست و كشتار دام هاي آلوده، ‌مسير نقل و انتقال دام ها و شناسايي منبع عفونت و  تكنيك هاي مولكولي و بيوشيميايي توانسته اند با شناسايي سويه های مايكوباكتريومها از پيشرفت و شيوع ْآن جلوگيري نمايند. داوید و همکاران[4] (1987) شناسايي سريع عفونت در گله هاي گاوهاي كشور براي جلوگيري از انتقال يك امر ضروري ميباشد زيرا مايكوباكتري هاي پاتوژن داراي دوره انكوباسيون طولاني مدت بوده و اين امر تشخيص آزمايشگاهي آن را با مشكل مواجه مي‌سازد. امروزه از مطالعات اپيدميولوژي سل در ارزيابي برنامه هاي كنترل بيماري، تعيين بروز و ميزان شيوع و از ژنوتايپينگ ايزوله ها و مولكولار اپيدميولوژي در قرابت و طبقه بندي سويه ها، ارتباط بين سل حيوانات مختلف و ساير فاكتور هاي دخيل در آن و همچنين رديابي منشاء  عفونت استفاده هاي شاياني مي‌نمايند. لذا بكارگيري روش هاي نوين جهت تشخيص اين بيماري بسيار ضروري ميباشد. امروزه تكنيك هاي مولكولي مانند انگشت نگاري ژنومي به روش [5]RFLP، براي شناسايي دقيق و متمايز نمودن ايزوله هاي مايكوباكتريوم ميباشد. داوید و همکاران(1987) پروب ها قطعه اي از ملكول هاي تك رشته اي RNAيا DNA  هستند كه به روشهاي مختلف نشان دار يا ليبل ميشوند. اين پروب ها با توالي نوكلئوتيدي مكمل خود با DNAي هدف، در شرايط ويژه آزمايشگاهي هيبريد مي‌شوند. سپس نواحي هيبريد شده به طرق مختلف رديابي شده تا تفاوت سويه ها به لحاظ جايگزيني پروب در نواحي خاص كروموزم نمايان گردند. پریراز و همکاران[6](2012) در اين مطالعه سعي شده است جدايه‌هاي بدست آمده باتكنيك RFLP با آنزيم PvuIIو استفاده از