دانشگاه آزاد اسلامی
واحد علوم و تحقیقات کرمان
دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی
پایان نامه جهت دریافت درجه کارشناسی ارشد در رشته زیست شناسی (M.A)
گرایش: میکروبیولوژی
عنوان:
جداسازی و شناسایی باکتری‌های تجزیه‌کننده‌ی ترکیبات آروماتیک
خليج فارس، منطقه ساحلی استان بوشهر
استاد راهنما:
دکتر مهدی حسن‌شاهیان
استاد مشاور:
دکتر سید محمد‌‌رضا خوشرو
تابستان 1392
برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود
(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
عنوان شماره صفحه
چکيده.. 1
فصل اول: کليات تحقيق
1-1- مقدمه.. 3
1-2- بيان مسئله.. 4
1-3- اهميت و ضرورت انجام تحقيق.. 5
1-4- ادبيات تحقيق.. 6
1-5- اهداف تحقيق.. 10
1-5-1 اهدف کلي.. 10
1-5-2 اهداف جزئي.. 10
1-5-3 اهداف کاربردي.. 11
1-6- سؤالات تحقيق.. 11
فصل دوم: مروری بر ادبیات و پیشینه تحقيق
2-1- خليج فارس.. 13
2-2- استان بوشهر.. 14
2-3- نفت و آلودگي‌هاي نفتي.. 15
2-4- ورود نفت به آب دريا.. 17
2-5- تغييرات نفت پس از ورود به آب دريا.. 17
2-5-1 پراکنده شدن.. 18
2-5-2 پخش شدن مواد نفتي در سطح آب.. 18
2-5-3 حل شدن.. 18
2-5-4 تبخير شدن.. 18
2-5-5 اکسيداسيون فتوشيميايي.. 18
2-5-6 بحالت امولسيون در آمدن.. 19
2-5-7 قابليت تجزيه زيستي.. 19
2-5-8 ته نشين شدن.. 19
2-6- تجزيه‌زيستي.. 20
2-7- معرفي هيدروکربن‌هاي آروماتيک.. 20
2-7-1 طبقه‌بندي ترکيبات آروماتيک.. 20
2-7-2 فرمولاسيون ترکيبات آروماتيک.. 21
2-7-3 خواص فيزيکي و شيميايي.. 22
2-7-4 درجه سميت ترکيبات آروماتيک.. 23
2-7-5 اثرات هيدروکربن‌هاي پلي‌آروماتيک روي سلامتي انسان‌ها و موجودات زنده.. 27
2-7-6 هیدروکربن های پلی سیکلیک آروماتیک و سرطان.. 27
2-7-7 چه عاملي ترکيب را سرطان‌زا مي‌کند؟.. 27
2-8- فنل.. 28
2-8-1 کليات ترکيب فنل.. 28
2-8-2 نامگذاري.. 28
2-8-3 فنول‌هاي طبيعي.. 29
2-8-4 ساختمان مولکولي و خواص فيزيکي.. 29
2-8-5 خواص فيزيکي.. 29
2-8-6 تأثير فنل بر محيط زيست و موجودات زنده.. 30
2-8-7 کاربردها.. 30
2-9- تجزيه‌زيستي.. 30
2-9-1 روش‌هاي پاکسازي بيولوژيکي.. 31
2-9-2 مباني زيست‌درماني.. 32
2-9-3 ميکروارگانيسم‌هاي هوازي.. 32
2-9-4 ميکروارگانيسم‌هاي بي‌هوازي.. 32
2-9-5 مخمرها و قارچ‌ها.. 33
2-9-6 استفاده از بيوراکتور‌ها.. 33
2-9-7 کو‌متابوليسم.. 34
2-9-8 دي‌نيتريفيکاسيون.. 34
2-9-9 کمپوست کردن.. 34
2-9-10 درمان بيولوژيکي.. 34
2-10- ميکروارگانيسم هاي تجزيه کننده ترکيبات آروماتيک.. 35
2-11- مسير هاي تجزيه زيستي.. 36
2-11-1 تجزيه ميکروبي فنل.. 36
2-11-2 تجزيه ميکروبي نفتالين.. 39
فصل سوم: روش شناسی تحقیق
3-1- محيط کشت‌هاي مورد استفاده.. 44
3-1-1 محيط ONR7a. 44
3-1-2 محيط (ONR7a + نفتالين) آگار.. 45
3-1-3 محيط) +ONR7a فنل( آگار.. 45
3-1-4 محيط مارين براث (MB).. 45
3-1-5 محيط مارين آگار (MA).. 46
3-1-6 محيط نوترينت براث (NB).. 46
3-1-7 محيط نوترينت آگار (NA).. 46
3-2- محلول‌ها.. 47
3-2-1 سرم فيزيولوژي.. 47
3-2-2 محلول اتيلن‌دي‌‌آمينو‌تترا‌استيک‌اسيد (EDTA).. 47
3-2-3 محلول Tris-Base. 48
3-2-4 محلول TBE.. 48
3-2-5 محلول EDTA Tris-Base- (TE) 48
3-2-6 محلول اتيديوم برومايد.. 48
3-3- مواد مصرف شده در PCR.. 49
3-4- دستگاه‌هاي مورد استفاده.. 49
3-5- روش عملي.. 50
3-5-1 نمونه برداري به منظور جداسازي باکتري هاي تجزيه کننده 50
3-5-2 شمارش باکتري هاي موجود در محيط.. 51
3-5-2-1 شمارش باکتري هاي هتروتروف.. 51
3-5-2-2 شمارش باکتري‌هاي تجزيه‌کننده نفتالين.. 51
3-5-2-3 شمارش باکتري‌هاي تجزيه‌کننده فنل.. 51
3-5-3 جداسازي باکتري هاي تجزيه کننده.. 51
3-5-3-1 جداسازي و غربالگري باکتري هاي تجزيه کننده.. 51
3-5-3-2 تست هاي تکميلي.. 52
3-5-3-2-1 سنجش رشد باکتري.. 52
3-5-3-2-2 فعاليت امولسيون‌کنندگي (E24) 52
3-5-3-2-3 سنجش حذف فنل.. 52
3-5-3-2-4 سنجش حذف نفتالين.. 52
3-5-4 شناسايي باکتري ها.. 53
3-5-4-1 استخراج DNA ژنومي با روش فنل کلروفورم.. 53
3-5-4-2 تعيين غلظت DNA استخراج شده.. 54
3-5-4-3 برنامه وغلظت مواد مورد استفاده در PCR.. 54
3-5-4-4 بررسي محصول PCR.. 54
3-5-4-5BLAST کردن نتايج حاصل از توالي يابي نوکلئوتيدي نمونه ها.. 55
فصل چهارم: نتايج یافته های تحقیق
4-1- نمونه برداري.. 57
4-2- شمارش باکتري ها.. 58
4-2-1 شمارش تعداد کل هتروتروف‌ها.. 58
4-2-2 شمارش تعداد کل تجزيه کننده‌ها.. 60
4-3- نکات ايمني جهت استفاده از فنل و نفتالين.. 61
4-4- جداسازي ميکروارگانيسم هاي تجزيه کننده.. 62
4-4-1 کشت نمونه‌ها در محيط ONR7a به اضافه فنل جهت جداسازي باکتري‌هاي تجزيه‌کننده فنل.. 62
4-4-2 کشت نمونه‌ها در محيط ONR7a به اضافه نفتالين جهت جداسازي باکتري‌هاي تجزيه کننده نفتالين.. 62
4-5- تست‌هاي تکميلي جهت انتخاب باکتري‌هايي با توان بالاي تجزيه فنل و نفتالين.. 63
4-5-1 سنجش ميزان رشد باکتري هاي تجزيه کننده فنل و نفتالين 63
4-5-2 فعاليت امولسيون کنندگي (E24).. 67
4-5-3 سنجش حذف ترکيبات آروماتيک.. 71
4-5-3-1 سنجش حذف نفتالين.. 71
4-5-3-2 سنجش حذف فنل.. 73
4-6- شناسايي مولکولي نمونه هاي تجزيه کننده ترکيبات آروماتيک 75
4-6-1 بررسي محصول PCR.. 75
4-6-2 BLAST کردن توالي نوکلئوتيدي نمونه ها.. 76
4-7- رسم درخت فيلوژني براي سويه‌ها.. 92
4-8- فاصله ژنتيکي بين سويه‌ها.. 94
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
5-1- بحث و نتیجه گیری.. 97
5-2- پيشنهادات.. 100
منابع و مآخذ.. 101
فهرست منابع فارسی.. 101
فهرست منابع انگلیسی.. 103
چکیده انگلیسی.. 108
فهرست جداول
عنوان شماره صفحه
جدول 2-1: 28 ترکيبات آروماتيک به ترتيب ميزان سميت. 23
جدول 3-1: ترکيبات محيط کشت ONR7a. 44
جدول 3-2: ترکيبات محيط کشت مارين براث (MB) 45
جدول 3-3: ترکيبات محيط کشت نوترينت براث. 46
جدول 3-4: ترکيبات سرم فيزيولوژي. 47
جدول 3-5: ترکيبات سرم فيزيولوژي. 47
جدول 3-6: توالي و خصوصيات پرايمرهاي مورد استفاده جهت شناسايي ژن 16 SrRNA.. 49
جدول 3-7: دستگاه هاي مورد استفاده و مدل آنها. 49
جدول 3-8: غلظت مواد مورد استفاده در PCR با پرايمرهايAlk 54
جدول 4-1: نامگذاري و معرفي نقاط نمونه گيري بر حسب مشخصات جغرافيايي 57
جدول 4-2: نتايج شمارش باکتري‌هاي هتروتروف. 59
جدول 4-3: نتايج شمارش کل باکتري هاي تجزيه کننده. 60
جدول 4-4: نتايج ميزان جذب نوري نمونه‌هاي تجزيه‌کننده فنل در طول موج 600 نانومتر. 64
جدول 4-5: نتايج ميزان جذب نوري نمونه‌هاي تجزيه‌کننده نفتالين در طول موج 600 نانومتر. 65
جدول 4-6: نتايج تست E24 براي نمونه‌هاي تجزيه‌کننده نفتالين 68
جدول 4-7: نتايج تست E24 براي نمونه‌هاي تجزيه‌کننده فنل. 70
جدول 4-8: نتايج جذب UV جهت بررسي درصد حذف نفتالين. 72
جدول 4-9: نتايج جذب UV جهت بررسي درصد حذف فنل. 74
جدول 4-10: برنامه رسم درخت فيلوژني سويه ها. 92
جدول 4-11: برنامه رسم جدول فاصله هاي ژنتيکي سويه ها. 94
جدول 4-12: فاصله ژنتيکي سويه ها. 94
فهرست نمودارها
عنوان شماره صفحه
نمودار 2-1: مسير تجزيه ميکروبي فنل. 36
نمودار 2-2: مسير تجزيه ميکروبي نفتالين. 39
نمودار 4-1: درصد حذف فنل توسط سويه‌هاي تجزيه‌کننده اين ترکيب 73
نمودار 4-2: درصد حذف فنل توسط سويه‌هاي تجزيه‌کننده اين ترکيب 74
فهرست شکل ها
عنوان شماره صفحه
شکل 2-1: فرمول ککوله حلقه بنزن. 21
شکل 2-2: فرمول ساختاري بنزن. 21
شکل 2-3: نمايش موقعيت جانشيني روي حلقه دي متيل بنزن. 21
شکل 2-4: برخي از آروماتيک هاي چند هسته اي فشرده. 22
شکل 2-5: فرمول تترالين يا تتراهيدرونفتالن. 22
شکل 2-6: مکانيسم هاي بروز سرطان. 26
شکل 2-7: فرمول ساختاري فنل. 28
شکل 4-1: پوشش کارشناس و نحوه قرار گيري صحيح در حين انجام کار با ترکيبات آروماتيک زير هود. 62
شکل 4-2: نمونه‌هاي کشت داده شده در محيط اختصاصي به اضافه فنل و نفتالين. 63
شکل 4-3: نتايج تست E24 فعاليت امولسيون کنندگي. 67
شکل 4-4: فاز آلي و آبي تفکيک شده در دکانتور, فاز آلي در قسمت بالا شامل هگزان و نفتالين و فاز آبي در پايين شامل ترکيبات محيط کشت اختصاصي و باکتري مي باشد.. 71
شکل 4-5: بررسي محصول PCR بر روي ژل آگارز. 75
شکل 4-6: درخت فيلوژني نمونه‌ها. 92
شکل 4-7: درخت فيلوژني نمونه‌هاي جداسازي شده با مشخص بودن نتايج BLAST.. 93
چکيده
ترکيبات آروماتيک, جز آلاينده‌هاي نفتي بوده که در ساختمان مولکولي آنها حلقه‌هاي بنزني بکار رفته و به لحاظ پايداري در محيط‌هاي آبي از اهميت خاصي برخوردار هستند. از آنجا که اين ترکيبات بعنوان آلاينده‌هاي مهم در فهرست سازمان حفاظت از محيط زيست آمريکا آمده‌اند و از طرفي که سال 2013 بعنوان سال جهاني حفاظت از محيط زيست نامگذاري شده است و در دهه‌هاي اخير به دلايل مختلف آلودگي آب خليج‌فارس بعنوان يک محيط بسته دريايي به اين ترکيبات افزايش يافته است. هدف از اين تحقيق جداسازي و شناسايي باکتري‌هاي تجزيه‌کننده ترکيبات آروماتيک از نوار ساحلي استان بوشهر در خليج‌فارس است. يکي از روش‌هاي کاهش آلاينده‌هاي مختلف, روش بيولوژيک و استفاده از ميکروارگانيسم ها جهت پاکسازي اينگونه آلاينده‌ها است. در اين مطالعه تعداد 25 نمونه آب, 6 نمونه خاک و 4 آب و خاک از نقاط مختلف با پراکنش مشخص از نوار ساحلي استان بوشهر جمع آوري گرديد نمونه‌ها به محيط اختصاصي ONR7a منتقل شد, سپس در محيط نوترينت آگار کشت داده شده و بر باکتري‌هاي جدا شده تست‌هاي ميزان رشد و فعاليت امولسيون کنندگي (E24) و سنجش حذف براي بررسي ميزان تجزيه فنل و نفتالين انجام شد. از باکتري‌هاي جدا شده جهت تشخيص مولکولي, جداسازي DNA انجام شد, سپس توسط پرايمرهاي Uni_1492R و Bac 27_F مورد PCR قرار گرفت و در نهايت تعداد 9 باکتري به عنوان تجزيه کننده فنل و نفتالين معرفي شدند. نتايج اين تحقيق به وجود آلودگي به فنل و نفتالين در نوار ساحلي استان بوشهر و تفکيک منطقه‌اي هر باکتري انجاميد. سپس با توجه به رسم درخت فيلوژني و بررسي فاصله بين نمونه‌ها از صحت نتايج اطمينان حاصل شد.
کلمات کليدي: تجزيه ميکروبي, ترکيبات آروماتيک, منطقه ساحلي استان بوشهر, خليج‌فارس, واکنش زنجيره‌اي پليمراز (PCR).
مقدمه
خليج‌فارس به دليل شرايط اقليمي ويژه‌ي حاکم بر آن بسيار شکننده و آسيب‌پذير است و ورود کمترين آلاينده‌ها به داخل دريا اثرات مخربي بر سلامت آبزيان و موجودات آن دارد. خليج‌فارس با تمام مشکلات محيطي و اقليمي که بر آن حاکم است از تنوع ژني بالايي برخوردار است. از طرفي خليج‌فارس محل حمل و نقل جهاني محسوب مي‌شود و اين امر موجب شده در سال‌هاي گذشته لکه‌هاي نفتي بسياري از اين نفت‌کش‌ها در آب‌هاي خليج‌فارس به جا بماند, از طرفي آلاينده‌هاي صنايع حاشيه سواحل وارد آب اين دريا مي‌شوند و همچنين بخشي از آلاينده‌ها بر اثر حرکت نفت‌کش‌ها و شناورها, رها کردن آب توازن کشتي‌ها- حفاري و عمليات کشف نفت- تراوش و استخراج نفت و ريختن زباله‌ها از داخل شناورها به خليج‌فارس تزريق مي‌شوند. مرجان‌هاي زيبا و گونه‌هاي نادر گياهي و جانوري در حالي قرباني توسعه بي رويه غير اصولي و هجوم انواع آلاينده‌ها به درون دريا مي‌شوند که هنوز سازمان حفاظت از محيط زيست به عنوان دستگاه متولي حفظ محيط زيست نتوانسته اقدام موثر و شايسته‌اي در اين زمينه انجام دهد. که در نهايت اينگونه بي‌توجهي‌ها منجر به مرگ و مير آبزيان و مهاجرت آنها به خارج از منطقه, تغييرات در تنوع زيستي و کاهش تنوع زيستي و تغيير رفتار موجودات در محيط زيست منطقه مي‌شود که از جمله آثار ناشي از آن آلودگي درياهاست.
بخش اعظم آلاينده‌هاي موجود در خليج‌فارس از نوع نفتي است, از طرفي نفت از ميليون‌ها ترکيب تشکيل شده است که در کل مي‌توان آنها را در 4 دسته تقسيم‌بندي کرد که عبارتند از ترکيبات آروماتيک, هيدروکربن‌هاي اشباع, رزين‌ها و آسفالتن‌ها. از طرفي ترکيبات آروماتيک با توجه به تعداد حلقه‌هاي بنزني به کار رفته در ساختارشان تقسيم‌بندي مي‌شوند که در اين پروژه از فنل بعنوان يک ترکيب آروماتيک تک حلقه و از نفتالين بعنوان يک ترکيب دو حلقه استفاده شده است. ترکيبات آروماتيک از طريق استنشاق, بلعيدن و تماس مستقيم با پوست قابليت ورود به بدن داشته و در صورت بروز اين رخداد منجر به بروز علايمي چون استفراغ, سرگيجه و اسهال مي‌شود و با توجه به خصوصيات شيميايي که دارا مي‌باشند, توانايي ايجاد جهش در ژنوم موجودات زنده را دارند و مي‌تواند منجر به بروز سرطان در موجود زنده شوند. در اين پروژه با بررسي آلودگي منطقه ساحلي استان بوشهر به ترکيبات آروماتيک موفق به جداسازي و شناسايي 9 سويه تجزيه کننده ترکيبات آروماتيک شده و با رسم درخت فيلوژني به بررسي جد مشترک ميکروارگانيسم‌ها پرداخته‌ايم. بطور کلي اين پايان نامه از 5 فصل تشکيل شده است که عبارتند از فصل اول شامل کليه قسمت‌هاي مربوط به پروپوزال جهت بيان مسئله و ارائه ضروريات اجرايي شدن مسئله و اهداف پروژه. فصل دوم مروري بر ادبيات و پيشينه تحقيق. فصل سوم شامل روش اجراي تحقيق مي‌باشد.در فصل چهارم به تجزيه و تحليل داده‌ها پرداخته ودر نهايت در فصل پاياني به بحث و نتيجه‌گيري و بيان پيشنهادات مي‌پردازيم.
تعداد صفحه : 127
قیمت : 14700تومان