دانلود متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته زيست شناسي

عنوان : بررسي اتصال و تشکيل بيوفيلم باکتريايي بر روي سطوح و اثر عوامل ضد ميکروبي بر روي آن 

دانشگاه اصفهان

دانشکده علوم

گروه زيست شناسي

پايان نامه ي کارشناسي ارشد رشته ي زيست شناسي گرايش ميکروبيولوژي

بررسي اتصال و تشکيل بيوفيلم باکتريايي بر روي سطوح و اثر عوامل ضد ميکروبي بر روي آن 

استاد راهنما:

دکتر روحا کسري کرمانشاهي

استاد مشاور:

دکتر گيتي امتيازي

خرداد ماه 1384

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

چکيده

بيوفيلم بيانگر يك جامعه است كه در آن ارتباطات دروني بين گروه‌هاي متفاوت باکتري وجود دارد. بيوفيلم مي‌تواند از يك گونه و يا گونه‌هاي مختلف ميكروبي تشكيل شود. اين ساختار نشان مي‌دهد كه ميكروارگانيسم‌ها توانايي به كار گرفتن ميان كنش‌هاي بين سلولي براي سازگاري خود با تغيير پارامترهاي محيطي را دارند. اكثر بيوفيلم‌ها داراي يك جمعيت ناهمگون از سلول‌ها، چند لايه ي احاطه شده در يك ماتريكس پلي‌ساكاريدي و كانال‌هاي آب هستند. هدف اين تحقيق بررسي ساختمان بيوفيلم ها، همچنين بررسي اتصال باکتري هاي بيوفيلم به سطوح به منظور درک خصوصيات سطحي باکتري هاي بيوفيلم و در نهايت سنجش اثر بعضي از عوامل ضد ميکروبي روي بيوفيلم به منظور حذف بيوفيلم  يا کشتن سلول هاي درون آن مي باشد. در اين تحقيق ابتدا از بيوفيلم هاي موجود در سيسـتم خنـک کننده کارخانـه پلي اکريل اصفهان نمونه برداري صورت گرفت. سپس باکتري هاي g+  و g  بيوفيلم جداسازي و شناسايي شدند. در ادامـه، بـراي بـررسـي خصـوصـيات سطـحي ايـن باکتـري هـا، از روش هــاي MATH ، Co- MATH ،Bio- MATH ، اسلايد شيشه اي و ميکروپليت استفاده شد. سپس بررسي ساختمان بيوفيلم توسط ميکروسکوپ نوري و الکتروني انجام شد. در نهايت کارآيي اثر چند بيوسايد با غلظت هاي متفاوت روي بيوفيلم به منظور حذف بيوفيلم و کشتن سلول هاي درون آن از طريق روش جديد ميکروپليت مورد سنجش قرار گرفت. نتايج حاصل از اين تحقيق نشان داد که باکتري هاي بيوفيلم داراي خصوصيات سطحي بسيار متفاوت مي باشند. همچنين باکتري ها به طور برنامه ريزي شده بيوفيلم را تشکيل مي دهند و مي توانند ساختار هاي منحصر به فردي را بوجود آورند. در نهايت در اين تحقيق، قابليت بيوسايد هاي مورد آزمايش از نظر توانايي در حذف يا کشتن سلول هاي درون بيوفيلم، نشان داد که توانايي حذف بيوفيلم باکتري ها به طور جداگانه و بيوفيلم مخلوط آن ها با هم، توسط بيوسايد هاي اکسيد کننده مثل هيدروژن پراکسايد و هيپوکلريت سديم در مقايسه با غير اکسيد کننده ها مثل سولفاتيازول و الکيل دي متيل آمونيوم کلرايد بسيار بالا مي باشد. در نتيجه اين بيوسايد ها براي کنترل بيوفيلم هاي پايدار روي سطح، مناسب مي باشند. همچنين مشخص شد که بيوسايد هاي غير اکسيد کننده در کنترل بيوفيلم هاي پايدار کارآيي ندارند. در حقيقت اين بيوسايد ها را بايد براي جلوگيري از رشد بيوفيلم به کار برد. يعني در حالتي که بيوفيلم هنوز رشد نکرده است کاربرد اين بيوسايد ها مناسب مي باشد. زيرا در کشتن سلول هاي باکتريايي کارآيي خوبي دارند.

 

فهرست مطالب

عنوان……………………………………….. صفحه

 

فصل اول: مروري بر منابع……………………….. 1

1- مقدمه…………………………………….. 1

1-1- جوامع ميكروبي……………………………. 1

1-2- رفتارهاي جمعي……………………………. 2

1-3- ساختار و تمايز در بيوفيلم‌ها……………….. 2

1-4- فوائد اكولوژيكي؛ چرا يك بيوفيلم تشكيل مي‌شود؟… 3

1-4-1- حفاظت در برابر محيط اطراف……………….. 3

1-4-2- محافظت در برابر مواد ضد عفوني كننده………. 4

1-4-3- كسب مواد غذايي و همكاري‌هاي متابوليكي……… 4

1-4-3-1- كسب مواد غذايي……………………….. 4

1-4-3-2- همكاري‌هاي متابوليكي…………………… 5

1-4-4- كسب خصوصيات ژنتيك جديد………………….. 5

1-4-5- جنبه‌هاي ژنتيكي تشكيل بيوفيلم…………….. 6

1-5-فرايندهاي اوليه در تشكيل بيوفيلم و تمايز ساختاري حاصل از آنها  7

1-5-1- تمايز ساختاري………………………….. 7

1-5-2- تمايز فنوتيپي و اتصال اوليه……………… 8

1-5-3- اتصال برگشت‌ناپذير………………………. 8

1-6- بلوغ بيوفيلم…………………………….. 9

1- 7-كنده شدن به عنوان يك بخش از تكامل بيوفيلم…… 9

1- 8- تشكيل بيوفيلم به عنوان يك فرايند تكاملي……. 11

1-9- ارتباطات سلول-سلول در طول تشكيل بيوفيلم…….. 12

1- 10- خصوصيات بارز بيوفيلم……………………. 13

1-10-1- بيوفيلم به عنوان جوامع ميكروبي مرتبط از نظر فيزيولوژيكي    13

1-10-2- بيوفيلم به عنوان جوامع ميكروبي مرتبط از نظر رفتاري    13

1-10-3- بيوفيلم به عنوان جوامع ميكروبي با ساختار پيشرفته  13

1-11- فاكتورهاي شركت كننده در گسترش و بلوغ بيوفيلم.. 14

1-11-1- جنس سطح مواد………………………….. 15

1-11-2- مناسب بودن سطح مورد نظر………………… 15

1-11-3- صاف و صيقلي بودن سطح…………………… 15

1-11-4- شدت جريان آب………………………….. 15

1-11-5- محدوديت مواد غذايي…………………….. 16

1-12- بيوفيلم و انسان…………………………. 16

1-13- بيوفيلم در سيستم‌هاي آبي………………….. 18

1-14- فرايندهاي تميزسازي………………………. 20

1-15- ميكروارگانيسم‌هاي برج‌هاي خنك كننده…………. 21

1-15-1- جلبك‌ها……………………………….. 22

1-15-2- قارچ‌ها……………………………….. 23

1-15-3- باكتري‌ها……………………………… 24

1-16- چگونگي تغذيه‌باكتري‌ها در آب……………….. 25

1-17- مشكلات ايجاد شده در سيستم‌ برج‌هاي خنك كننده‌ توسط باكتري‌ها 25

1-18- خوردگي ميكروبي………………………….. 27

1-19- مسائل خوردگي……………………………. 27

1-20- مسائل ايجاد رسوبات………………………. 28

1-21- باكتري‌هاي توليد كننده‌ي لايه لعابي………….. 29

1-22- مراحل ايجاد تخريب زيستي در سيستم برج‌هاي خنك كننده   30

1-23- بيوسايدها………………………………. 30

1-23-1- خصوصيات اصلي يك بيوسايد………………… 31

1-23-2- بيوسايدهاي اكسيد كننده…………………. 31

1-23-2-1- كلرين………………………………. 32

1-23-2-2- بروماين و مشتقات آن………………….. 33

1-23-2-3- اوزون………………………………. 34

1-23-2-4- پراكسيد هيدروژن……………………… 34

1-23-3- بيوسايدهاي غير اكسيد كننده……………… 34

1-23-3-1- گلوتارآلدئيد………………………… 35

1-23-3-2- تركيبات آمونيوم چهار ظرفيتي…………… 35

1-23-3-3- ايزوتيازولون‌ها………………………. 36

1-24- مكانيسم‌هاي مقاومت باكتري‌ها در بيوفيلم به عوامل ضد ميكروبي    38

1-24-1- جلوگيري از انتشار به درون بيوفيلم……….. 38

1-24-2- مقاومت از طريق آنزيم…………………… 38

1-24-4- حالت متابوليك ارگانيسم‌ها در بيوفيلم……… 39

1-24-3- واكنش خنثي‌سازي عوامل ضد ميكروبي توسط بيوفيلم 39

1-24-5- سازش ژنتيكي…………………………… 40

فصل دوم: مواد و روش ها………………………… 41

2-1- مواد و وسايل…………………………….. 41

2-1-1- دستگاه‌ها و وسايل مورد استفاده……………. 41

2-1-2- مواد ضد ميكروبي يا بيوسايدها…………….. 42

2-1-3- مواد مورد استفاده………………………. 42

2- 1-4- محيط‌هاي كشت…………………………… 43

2-2- سويه‌هاي باكتري مورد استفاده……………….. 44

2-2-1- سويه‌هاي ايزوله شده‌ي مورد استفاده در اين تحقيق 44

2-2-2- مشخصات سويه‌ي استاندارد مورد استفاده در اين تحقيق   44

2- 3- مواد و روش‌هاي به كار رفته براي نمونه‌برداري…. 45

2-3- 1-روش‌هاي به كار رفته براي نمونه‌برداري………. 45

2-3-1-1- روش نمونه‌برداري از آب سيستم و لايه‌هاي بيوفيلم موجود در ديواره‌ي برج‌هاي خنك كننده……………………………… 45

2-3-1- 2- نمونه‌برداري از طريق گذاشتن كوپن‌هاي فلزي در معرض جريان آب سيستم خنك كننده……………………………………. 47

2-4- روش‌هاي به كار رفته براي جداسازي و شناسايي باكتري‌هاي تشكيل دهنده‌ي بيوفيل روي سطح كوپن و يا باكتري‌هاي موجود در آب نمونه‌برداري شده 48

2-4- 1- روش به كار رفته براي كشت و جداسازي باكتري‌ها. 48

2-4-1-1- روش جداسازي و كشت باكتري‌ها از نمونه‌ي كوپن.. 48

2-4-1-2- روش جداسازي و كشت باكتري‌ها از نمونه‌ي آب سيستم    48

2-4-2- شناسايي باكتري‌هاي جداسازي شده……………. 49

2-4-2-1- روش به كار رفته براي شناسايي باكتري‌ها…… 49

2-4-2-2- باكتري‌ استاندارد……………………… 49

2-4-2-3-  نمودار هاي شناسايي باكتري‌ها…………… 49

2-4-2-3-1- شناسايي اوليه‌ي باكتري‌هاي جنس باسيلوس….. 50

2-4-2-3-2- شناسايي مربوط به باكتري ميكروكوكوس لوتئوس 51

2-4-2-3-3- شناسايي اوليه‌ي باكتري‌هاي جنس آسينتوباكتر و برانهاملا 52

2-4-2-3-4- شناسايي اوليه‌ي باكتري‌ اکتينوباسيلوس…… 53

2-5- روش‌هاي به كار رفته براي سنجش هيدروفوبيسيتي سطح سلول‌هاي پلانكتونيك   54

2-5-1- روش به كار رفته براي تعيين هيدروفوبيسيتي سطح سلول‌هاي پلانكتونيك   54

2- 5-1-1- روش MATH براي سنجش هيدروفوبيسيتي سطح سلول‌ها     54

2-6- روش‌ به كار رفته براي سنجش هم اتصالي بين سويهء Micrococcus  با ساير باكتري‌هاي جدا شده از بيوفيلم…………………… 56

2-6-1- روش آزمايش co-adhesion MATH براي تعيين هم اتصالي   57

2-7- روش‌ به كار رفته براي سنجش هيدروفوبيسيتي سطح سلول‌هاي موجود در بيوفيلم……………………………………………. 58

2-7-1- روش MATH براي سلول‌هاي موجود در بيوفيلم……. 58

2-7- 1-1- روش تست لوله‌اي براي سلول‌هاي موجود در بيوفيلم    58

2-7-1-2- روش انجام آزمايش MATH براي سلول‌هاي موجود در بيوفيلم  59

2- 8- روش‌هاي به كار رفته در ارزيابي قدرت اتصال هر يك از باكتري‌ها به سطوح و بررسي ساختار بيوفيلم………………………….. 59

2-8-1- روش تشكيل بيوفيلم روي اسلايدهاي شيشه‌اي به منظور رديابي تشکيل بيوفيلم……………………………………………. 60

2-8-1-1- روش رنگ‌آميزي اسلايدهاي شيشه‌اي…………… 61

2-8-1-2- روش شمارش و شناسايي باكتري‌هاي متصل به سطح اسلايد  61

2-8-2- تعيين كمي تشكيل بيوفيلم و مقايسه‌ي بين قدرت باكتري‌هاي ايزوله شده براي تشكيل بيوفيلم……………………………. 64

2-8-2-1- روش ميكروتيتر پليت براي تعيين كميت تشكيل بيوفيلم توسط باكتري‌ها 64

2-8-3-بررسي ساختار بيوفيلم ها توسط ميکروسکوپ الکتروني اسکنينگ 67

2-8-3-1-  تهيه نمونه براي ميکروسکوپ الکتروني اسکنينگ 67

2-8-3-2- مکانيسم هاي تصوير سازي توسط ميکروسکوپ الکتروني   67

2-8-3-2-1- مکانيسم SE…………………………. 67

2-8-3-2-2- مکانيسم BSE ……………………….. 68

2-9- روش‌ به كار رفته در ارزيابي قدرت حذف و يا ازبين بردن سلول‌هاي مولد بيوفيلم توسط عوامل ضد ميكروبي………………….. 68

2-9-1- تهيه‌ي بيوسايدها با رقت‌هاي مورد نظر بر حسب ppm      69

2-9-1-1-  تهيه‌ي رقت از بيوسايدهاي مايع………….. 69

2-9-1-2- تهيه‌ي رقت از بيوسايدهاي جامد…………… 70

2-9-1-3- روش انجام آزمايش ميكروتيتر پليت براي تعيين پتانسيل حذف بيوفيلم توسط بيوسايدها……………………………….. 70

2-9-2- روش ميكروتيتر پليت براي تعيين پتانسيل كشتن سلول‌هاي مولد بيوفيلم توسط بيوسايدها……………………………….. 71

2-9-2-1-  تهيه‌ي رنگ تري فنيل تترازوليوم كلرايد 2%… 72

2-9-2-2- روش انجام آزمايش ميكروتيترپليت براي تعيين پتانسيل كشتن سلول‌هاي مولد بيوفيلم و موجود در آن توسط عوامل ضد‌ميكروبي….. 73

فصل سوم: نتايج و مشاهدات……………………. 74

3-1- جداول شناسايي و تست هاي بيوشيمي سويه هاي ايزوله شده  75

3-1-1- باسيلوس ها…………………………….. 75

3-1-2- ميکروکوکوس لوتئوس………………………. 75

3-1-3- اسينتوباکتر ها…………………………. 76

3- 2- نتايج مربوط به تعيين هيدروفوبيسيتي سطح سلول ها 77

3-2-1- نتايج مربوط به تعيين هيدروفوبيسيتي سطح سلول هاي پلانکتونيک   77

3-2-2- نتايج مربوط به سنجش هم اتصالي بين سويه ميکروکوکوس لوتئوس با ساير باکتري ها……………………………………. 78

3-2-3- نتايج مربوط به سنجش هيدروفوبيسيتي سطح سلول هاي موجود در بيوفيلم  79

3-3- نتايج حاصل از روش ميکروتيتر پليت براي تعيين کميت تشکيل بيوفيلم و مقايسه بين قدرت باکتري هاي ايزوله شده براي تشکيل بيوفيلم  80

3-4- نتايج مربوط به رديابي تشکيل بيوفيلم توسط ميکروسکوپ نوري  81

3-5- نسبت رشد سلول ها درون بيوفيلم در مدت زمان 24 ساعت    84

3-6- نتايج مربوط به مقايسه اتصال باکتري ها در بيوفيلم مخلوط به سطح اسلايد شيشه اي……………………………………… 84

3-7-  نتايج مربوط به بررسي بيوفيلم باکتري ها توسط ميکروسکوپ الکتروني اسکنينگ……………………………………… 86

3-8-  نتايج مربوط به تعيين پتانسيل حذف بيوفيلم و کشتن سلول هاي درون بيوفيلم توسط بيوسايد ها……………………….. 91

3-8-1- اثر حذفي( ستون هاي CV) و کشندگي(ستون هاي TTC) هيپوکلريت سديم در غلظت هاي مختلف روي بيوفيلم باکتري ها به طور جداگانه و روي بيوفيلم مخلوط باکتري ها(سويه هاي اسينتوباکتر، باسيلوس و ميکروکوکوس با هم)   91

3-8-2- اثر حذفي( ستون هاي CV) و کشندگي(ستون هاي TTC)H2O2 در غلظت هاي مختلف روي بيوفيلم باکتري ها به طور جداگانه و روي بيوفيلم مخلوط باکتري ها(سويه هاي اسينتوباکتر، باسيلوس و ميکروکوکوس با هم)…….. 95

3-8-3- اثر حذفي( ستون هاي CV) و کشندگي(ستون هاي TTC) گلوتار آلدهيد در غلظت هاي مختلف روي بيوفيلم باکتري ها به طور جداگانه و روي بيوفيلم مخلوط باکتري ها(سويه هاي اسينتوباکتر، باسيلوس و ميکروکوکوس با هم) 98

3-8-4- اثر حذفي( ستون هاي CV) و کشندگي(ستون هاي TTC) سولفاتيازول در غلظت هاي مختلف روي بيوفيلم باکتري ها به طور جداگانه و روي بيوفيلم مخلوط باکتري ها(سويه هاي اسينتوباکتر، باسيلوس و ميکروکوکوس با هم) 101

3-8-5- اثر حذفي( ستون هاي CV) و کشندگي(ستون هاي TTC) آلکيل دي متيل بنزيل آمونيوم کلرايد در غلظت هاي مختلف روي بيوفيلم باکتري ها به طور جداگانه و روي بيوفيلم مخلوط باکتري ها(سويه هاي اسينتوباکتر، باسيلوس و ميکروکوکوس با هم)…………………………………………. 104

فصل چهارم: بحث……………………………. 107

4-1- بررسي هيدروفوبيسيتي سطح سلول هاي پلانکتونيک….. 107

4- 2-بررسي هم اتصالي بين سويه ميکروکوکوس لوتئوس با ساير باکتري ها  109

4-3- بررسي هيدروفوبيسيتي سطح سلول هاي موجود در بيوفيلم    110

4-5- بررسي اتصال باکتري ها به سطوح مورد آزمايش…… 112

4-6- بررسي و رديابي تشکيل بيوفيلم………………. 113

4-7- بررسي رشد سلول ها درون بيوفيلم…………….. 116

4-8- بحث و بررسي در مورد تعيين پتانسيل حذف بيوفيلم و کشتن سلول هاي درون بيوفيلم توسط بيوسايد ها……………………….. 117

4-9- بررسي مدل نفوذ بيوسايد به درون بيوفيلم……… 121

جمع بندی نهايی……………………………….. 123

پيشنهادات……………………………………. 124

فصل پنجم: منابع و مأخذ……………………… 125

فهرست شکل ها

عنوان                                                                                                                      صفحه

فصل اول: مقدمه

شکل 1-1- ……………………………………. 11

فصل دوم: مواد و روش ها

شکل 2-1-…………………………………….. 46

شکل 2-2-…………………………………….. 46

شکل 2-3-…………………………………….. 50

شکل 2-4-…………………………………….. 51

شکل 2-5-…………………………………….. 52

شکل2-6-……………………………………… 53

شکل2-7-……………………………………… 64

فصل سوم: نتايج

شکل 3-1-…………………………………….. 77

شکل 3-2-…………………………………….. 78

شکل 3-3-…………………………………….. 79

شکل 3-4-…………………………………….. 80

شکل 3-5-…………………………………….. 81

شکل 3-6-…………………………………….. 82

شکل 3-7-…………………………………….. 82

شکل 3-8-…………………………………….. 83

شکل 3-9-…………………………………….. 83

شکل 3-10-……………………………………. 84

شکل 3-11-……………………………………. 85

شکل 3-12-……………………………………. 86

شکل 3-13-……………………………………. 87

شکل 3-14-……………………………………. 88

شکل 3-15-……………………………………. 89

شکل 3-16-……………………………………. 89

شکل 3-17-……………………………………. 90

شکل 3-18-……………………………………. 92

شکل 3-19-……………………………………. 93

شکل 3-20-……………………………………. 94

شکل 3-21-……………………………………. 95

شکل 3-22-……………………………………. 96

شکل 3-23-……………………………………. 97

شکل 3-24-……………………………………. 98

شکل 3-25-……………………………………. 99

شکل 3-26-……………………………………. 100

شکل 3-27-……………………………………. 101

شکل 3-28-……………………………………. 102

شکل 3-29-……………………………………. 103

شکل 3-30-……………………………………. 104

شکل 3-31-……………………………………. 105

شکل 3-32-……………………………………. 106

 

 

فهرست جدول ها

عنوان                                                                                                                       صفحه

فصل اول: مقدمه

جدول 1-1-……………………………………. 17

جدول  1-2-…………………………………… 18

جدول 1-3-……………………………………. 23

جدول 1-4-……………………………………. 24

جدول 1-5-……………………………………. 25

جدول 1-6-……………………………………. 37

فصل سوم: نتايج

جدول 3- 1-…………………………………… 75

جدول 3- 2-…………………………………… 76

جدول 3- 3-…………………………………… 76

جدول 3-4-……………………………………. 80

جدول 3-5-……………………………………. 85

مقدمه

1-1- جوامع ميكروبي

از جنبه ها‌ي اكولوژيكي، جمعيت‌هاي باكتري هاي حاصل از يك سلول و جمعيت‌هاي مشابه از نظر متابوليكي يك مجموعه را تشكيل مي‌دهند. مجموعه‌ي اين تجمع ها (براي مثال باكتري‌هاي متانوژنيك، احياء كننده‌هاي سولفات و سولفور و تخمير كننده‌ها) فرآيندهاي فيزيولوژيكي مرتبط با هم را انجام مي‌دهند(24).

در اصل، بيوفيلم[1] بيانگر يك جامعه است كه در آن ارتباطات دروني بين گروه‌هاي متفاوت وجود دارد. بيوفيلم مي‌تواند از يك گونه[2] و يا گونه‌هاي مختلف ميكروبي تشكيل شود. آنها مي‌توانند بر روي سطوح متفاوتي از زنده تا غير زنده تشكيل شوند. ميكروارگانيسم‌ها همچنين مي‌توانند اجتماعات طبيعي را در فضاي مابين آب و هوا تشكيل بدهند. در حقيقت، تعريف اصلي بيوفيلم به صورت زير مي‌باشد:

اجتماعات ميكروارگانيسم‌ها و محصولات خارج سلولي در ارتباط با آنها و در فضاي مابين آنها كه به يک سطح متصل شده اند. در ابتدا Claude Zobell مشاهده كرد كه باكتري‌ها زندگي بر روي يك سطح را به حالت آزاد ترجيح مي‌دهند و سپس در سال 1987 اين فرآيند را در سيستم‌هاي آب شيرين و اكوسيستم‌هاي متنوع ديگر مورد بررسي قرار داد(64).

تعداد صفحه : 216

قیمت : 14700تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        ———-        serderehi@gmail.com

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

***  *** ***

دسته بندی : زیست شناسی