دانشگاه دامغان
دانشکده زیست شناسی
پایان نامه کارشناسی ارشد
زیست شناسی (گرایش بافت شناسی و جنین شناسی)
تولید نوروسفر از سلولهاي بنیادی مزانشیمی مغز استخوان
استاد راهنما:
دکتر مریم حاجی قاسم کاشانی
اساتید مشاور:
دکتر محمد تقی قربانیان
دکتر تقی لشکر بلوکی
شهریور 1390
برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود
(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
تولید نوروسفر از سلولهاي بنیادی مزانشیمی مغز استخوان
هدف : هدف ما در این پژوهش پاسخ به این سوال است که آیا MSCs بعد از کشت طولانی مدت میتوانند به طورخودبخودی به سلولهای پیشساز عصبی تمایز یابند.
مواد وروشها: این تحقیق شامل دو گروه میباشد: کشت پاساژ پنجم MSCs در محیط کشت -MEMα و FBS %10 به مدت سه هفته بدون تعویض محیط یا استفاده از القاگر به عنوان گروه آزمایشی و پاساژ پنجم MSCs بدون کشت طولانی مدت به عنوان گروه کنترل. سپس هر گروه توسط واکنش زنجیرهای پلیمراز(RT- PCR) به منظور بیان ژنهای فاکتورهای نوروتروفیک ( NGF، BDNF، NT3، NT4/5و GDNF) و ژنهای نورونی (Nestin،TH وNurr1) ارزیابی شد. در این مطالعه، از ایمینوسیتوشیمی Nestin و βІІІ-tubulin به منظور تعیین سلولهایی که این نشانگرها را بیان میکنند استفاده شد.
نتایج: پاساژ پنجم MSCs که از موش صحرایی بالغ استخراج شدند، بعد از کشت طولانی مدت (سه هفته) قادرند بطور خودبخودی به سلولهای شبه نوروسفری تمایز یابند و به نشانگر نستین پاسخ مثبت میدهند. بعد از هفته دوم کشت، سلولهای شبه نورونی به نشانگر βІІІ-tubulin واکنش مثبت نشان دادند. بررسیهای آماری نشان داده است که MSCs در گروه آزمایشی افزایش معنیداری از ژنهای فاکتورهای نوروتروفیک NGF و GDNFو ژنهای نورونی Nestinو Nurr1 را نسبت به گروه کنترل نشان دادند .(p<0.05)
نتیجه گیری: در این مطالعه نشان داده شد که MSCs در کشت طولانی مدت، به طورخودبخودی به نوروسفر تمایز پیدا میکنند بدون اینکه با فاکتور رشد یا القاکننده خاص همراه شوند و قادرند ژنهای اختصاصی نورونهای دوپامینرژیک مانند THو Nurr1را بیان کنند. مطالعات ما نشان میدهد که MSCsدر شرایط کشت طولانی مدت توانایی تمایز به سلولهای نورونی را به طور خودبخودی دارا هستند و پیشنهاد میشود منبع سلولی مناسبی در درمان بیماریهای نورولوژیکی باشند.
کلید واژگان: سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان،کشت طولانی مدت، تمایز خودبخودی، نوروسفر
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول: مقدمه. 1
مقدمه و مروری بر مطالعات گذشته. 1
1-1 سلولهای بنیادی جنینی.. 3
1-2 سلولهای بنیادی بالغ. 4
1-3 سلولهای بنیادی مغز استخوان. 5
1-3-1 مارکرهای سطحی خاص سلولهای بنیادی مزانشیمی.. 8
1-3-2 تنظیم سیستم ایمنی توسط سلولهای بنیادی مزانشیمی.. 8
1-3-3 پتانسیل تمایزی سلولهای بنیادی مزانشیمی.. 10
1-4 کاربرد درمانی سلولهای بنیادی مزانشیمی.. 14
1-5 انواع فاکتورهای رشد عصبی (NTFs) و ساختمان مولکولی گیرندههای مربوط به آنها 17
1-5-1 فاکتورهای نوروتروفیک… 17
1-5-1-1 انواع فاکتورهای نوروتروفیک… 18
1-5-2 گیرندههای مربوط به فاکتورهای رشد عصبی.. 20
1-5-2-1 ساختار گیرنده P75NTR و اتصال نوروتروفین.. 20
1-5-2-2 ساختار گیرنده Trk و اتصال نوروتروفین.. 22
1-6 سلولهای بنیادی عصبی.. 25
1-6-1 نوروسفر. 25
1-6-1-1 نوروسفر منبعی برای سلول درمانی.. 31
1-7 ضرورت اهداف تحقیق.. 33
فصل دوم: مواد و روشها. 35
2-2 تهیه و نگهداری حیوان آزمایشگاهی.. 36
2-2 جداسازی و کشت سلولهای بنیادی مغز استخوان موش صحرایی بالغ. 36
2-2-1 طرز تهيه محیط کشت a-MEM.. 36
2-2-2 طرز تهيهPBS فاقد كلسيم و منيزيم (2/7 : PH) 37
2-2-3 طرز تهيه تريپسين/ EDTA. 37
2-2-4 روش جداسازی و کشت سلولهای بنیادی مغز استخوان. 39
2-2-5 پاساژ سلولی.. 39
2-3 تأييد هويت سلولهاي استرومايي به روش ايمونوسیتوشيمي.. 39
2-3-1 ايمونوسیتوشيمي CD71. 40
2-3-1-1 طرز تهيه پارافرمالدئيد 4%. 41
2-3-1-2 طرز تهيه ژلاتين 1/0 درصد. 41
2-3-1-3 ساخت سرم بز 10%. 41
2-3-1-4 طرز تهيه PBS ایمنوسیتوشیمی (4/7 – 2/7 = PH). 42
2-3-1-5 طرز تهيه بافر گليسرول.. 42
2-3-2 رنگ آمیزی آلکالین فسفاتاز 43
2-4بررسی مارکر عصبی βIII-tubulin در سلولهاي مزانشیمی مغز استخوان به روش ايمونوسیتوشيمي.. 44
2-5 تایید هویت عصبی نوروسفرها به روش ايمونوسيتوشيمي.. 45
2-6 بررسي مولكولي بيان ژنهاي اعضاي خانواده نوروتروفين.. 46
2-6-1 استخراج RNA كل از سلولهاي كشت شده 46
2-6-2بررسی کمی و کیفی RNA استخراج شده 48
2-6-3 الكتروفورز ژل آگارز 49
2-6-4 واکنش ساخت cDNA (واکنش رونویسی معکوسRT-) 52
2-6-5 انتخاب پرایمر. 53
2-6-6 آماده‌سازي پرايمرها 54
2-6-7 واكنش PCR. 54
2-7 آنالیز آماری.. 58
فصل سوم: نتایج… 59
3-1 مشاهده مورفولوژی سلولهاي مزانشیمی مغز استخوان در شرایط کشت با میکروسکوپ اینورت.. 59
3-2 تعیین هویت سلولهاي مزانشیمی مغز استخوان با نشانگر CD71 و آلکالین فسفاتاز. 60
3-3 ویژگیهای مورفولوژیکی سلولهاي مزانشیمی مغز استخوان بعد از کشت طولانی مدت.. 60
3-4 تأييد هويت سلولهاي عصبي با استفاده از روش ايمونوسيتوشيمي.. 60
3-5 تأييد هويت نوروسفرها با استفاده از نشانگر نستین.. 61
3-6 ارزيابي بيان ژنهای فاكتورهاي نوروتروفيك و مارکرهای نورونی و بررسی آماری شدت باندها و نمودارهای مربوط به آن 61
4-1 نتیجهگیری و بحث 70
4-1 مورفولوژی سلولهای بنیادی مزانشیمی در کشت طولانی مدت و تایید هویت آنها 71
4-2 بیان فاکتورهای رشد عصبی به وسیله سلولهای بنیادی مزانشیمی.. 72
4-3 پتانسیل تمایز سلولهای بنیادی مغز استخوان به سلولهای عصبی.. 74
4-4 توليد نوروسفر از سلولهاي بنيادي مغز استخوان در كشت طولاني مدت.. 76
4-5 نتيجه گيري.. 77
پیشنهادات.. 77
مراجع 79
فهرست شکلها
شکل 1-1. مسیرهای پیام رسانی که با واسطه P75NTR تنظیم میشود.. 22
شکل 1-2. نوروتروفینها و گیرندههای مربوط با آن:رسپتور تیروزین کیناز و P75NTR. 23
شکل 1-3. مسیرهای سیگنالینگ که با واسطه Trk تنظیم میشود. 24
شکل 1-4. سلولهای بنیادی عصبی و ردههای سلولی مربوط به آن.. 25
شکل 1-5 .ارزیابی شکلگیری نوروسفر. 26
شكل 1. تصاوير فاز كنتراست سلولهاي استرومايي مغز استخوان موش صحرايي در محيط كشت در پاساژهاي مختلف. 62
شكل 2. شناسايي سلولهاي استرومايي مغز استخوان موش صحرايي.. 63
شکل 3. تصویر فاز کنتراست از MSCs در پاساژ پنجم بعد از دو هفته 64
شکل 3. تصویر فاز کنتراست از پاساژ پنجم MSCs پس از هفته سوم. 65
شکل4 تأييد هويت سلولهاي عصبي با استفاده از روش ايمونوسيتوشيمي 66
شکل 5 تأييد هويت نوروسفرها با استفاده از نشانگر نستین 66
شكل6 A.الگوی بيان ژن فاکتورهای نوروتروفیک در پاساژ پنجم سلولهای بنیادی مزانشیمی (گروه کنترل) و B: گروه آزمایشی (کشت طولانی مدت). 67
شكل 6. C الگوی بيان ژن پیشساز عصبی و ژنهای اختصاصی سلولهای دوپامینرژیک در پاساژ پنجم سلولهای بنیادی مزانشیمی (گروه کنترل) و D. گروه آزمایشی (کشت طولانی مدت). 67
نمودار 6 A. مقايسه میزان بيان نسبی ژنهای فاکتورهای نوروتروفیک در گروه آزمایشی و کنترل.. 68
نمودار6 B.مقايسه میزان بيان نسبی ژنهای نورونی در گروه آزمایشی و کنترل.. 69
فهرست جدولها
جدول1-1 . اسامی گوناگون سلولهای بنیادی مزانشیمی.. 6
جدول1-2 اطلاعات مربوط به پرايمرها، F : پرايمر بالادست ، R : پرايمر پايين‌دست.. 57
مقدمه
امروزه تحقیق بر روی سلولهای بنیادی به دانش پیشرفتهای تبدیل شده است که نه تنها در حیات علمی، بلکه در بعد اقتصادی نیز موثر قلمداد میشود ]1[. سالهاست که این تفکر در ذهن دانشمندان شکل گرفته که با توجه به امکان تقسیم سلولی آیا میتوان درمان را بر پایه این سلولها بنا نهاد. این تفکر و تحقیق به تدریج به طرف طب جدیدی سوق داده میشود که از آن به عنوان reparative (regenerative) medicine نام برده میشود] 2[. پر واضح است برای رسیدن به این هدف، درک کامل بیولوژی سلولی و ماهیت سلولهای بنیادی از اهمیت ویژهای برخوردار است. خصوصا” علیرغم تحقیقات وسیع، هنوز ابهامات متعددی پیرامون نحوه عملکرد سلولهای بنیادی وجود دارد ]3[.
سلولهای بنیادی، سلولهای زایای[1] غیر بالغاند که قادر به خود تکثیری (Self-renewal) هستند و از این طریق جمعیت سلولی خود را حفظ میکنند]4[. هر سلول بنیادی در کنام یا نیچ[2] تنظیمی خود قرار گرفته است. کنام یک سلول، مجموعهای از عوامل فیزیکی و شیمیایی است که سلول را احاطه کرده است. از اعمال مهم کنام سلولهای بنیادی، تنظیم توازن بین خود نوزایی و تمایز است. یکی از مکانیسمهای تنظیم کننده این توازن کنترل تقسیم متقارن[3] و نامتقارن[4] میباشد. در تقسیم نامتقارن، از تقسیم سلول بنیادی دو سلول دختری ایجاد میگردد که یکی در کنام باقی مانده و دیگری کنام را ترک کرده تا تعداد زیادی پیش ساز ایجاد نماید و در نهایت به سلولهای بالغ تمایز پیدا میکنند. در عوض در تقسیم متقارن، دو سلولدختری ایجاد میگردد که هر دو در کنام باقی مانده و به صورت بنیادی باقی میمانند] 5، 6[. بنابراین سلولهای بنیادی، سلولهای تمایز نیافتهای میباشند که توانایی خود تکثیری، تولید نسل تمایز یافته عملکردی و ترمیم بافت بعد از صدمه را دارا هستند ]7[.
سلولهای بنیادی بر اساس قابلیت تمایز به سه گروه تقسیم میشوند:
همه توان[5]: جزء اولین سلولهایی هستند که در جنین شکل میگیرند ( از تخمک لقاح یافته 1-3 روزه)، قابلیت تمایز به انواع سلولهای ارگانیسم را دارند] 4[.
پر توان[6]: از توده سلولی داخلی[7] در مرحله بلاستوسیست 100تا 200 سلولی منشاء میگیرند. این سلولها دارای توانایی تمایز و تکثیر نامحدود هستند و قادرند به هر سه لایه سلولی تمایز یابند]7[.
چند توان[8]: اين گروه را سلولهاي بنيادي بالغ[9] و يا سلولهاي بنيادي سوماتيك نيز مي‌نامند که بصورت خاموش و غیر متعهد حفظ میشوند تا در آینده و بر اساس نیاز فعال شده و به سایر دودمانهای مربوط به همان بافت تمایز یابند]8[، به عنوان مثال سلولهاي بنيادي خونساز در مغز استخوان به تمام انواع سلولهاي خوني مانند گلبول‌هاي قرمز، لنفوسيت‌هاي B وT و … تمايز مي‌يابند [9،10[.
سلولهای بنیادی از لحاظ منشاٴ به دو دستهی، سلولهای بنیادی جنینی (ESCs)[10] و سلولهای بنیادی بالغ تقسیم میشوند. از آنجا که استفاده از سلولهای بنیادی جنینی با مسائل اخلاقی و قانونی بسیار مواجه است و یا پیوند این سلولها خطر ایجاد بافت توموری را در پی خواهد داشت ]7،11[، بنابراین کلید حل این مشکل به دست آوردن منبع عظیمی از سلولهاست به گونهایکه قابلیت تمایز بالایی داشته باشد و قادر باشند به دفعات نامحدودی در محیط کشت تکثیر شوند تا تعداد کافی سلول قابل دسترس برای پیوند و یا هر کاربرد درمانی و پژوهشی فراهم آورد]4[.
سلولهای بنیادی مزانشیمی از مهمترین سلولهای بنیادی بالغ است. این سلولها اولین بار توسط مطالعات Friedenstein و Petrokova در سال 1966 استخراج شدند ]12[. سلولهاي بنيادي مزانشيمي توان تمايز به چندين دودمان سلولي ازجمله استخوان، عصب، غضروف و كبد را دارند] 13 .[این سلولها به عنوان يك منبع ايدهآل براي سلول درماني، ژن درماني و به عنوان ابزاري براي درمان بيماريهاي مادرزادی محسوب میگردند] 14[. گزارشهایی مبنی بر استفاده از این سلولها در مدلهاي حيواني براي درمان جراحات نخاعي] 15،16[، سكتة مغزي ]17 [و پاركينسون] 18 [وجود دارد.
1 progenitor
2 Niche
3 symmetric
4 asymmetric
1 Totipotent
2 Pluripotent
3 Inner cell mass
4 Multipotent
5 adult Stem Cell
6 Embryonic Stem Cell
تعداد صفحه : 115
قیمت : 14700تومان