متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته :زیست شناسی

گرایش :میکروبیولوژی

عنوان : کلونینگ، بیان، تخلیص و بررسی فعالیت آنزیم سراپپتیداز حاصل از سراشیا مارسسنس

دانشگاه آزاد اسلامی

واحد ارومیه

دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

 

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد

رشته : زیست شناسی  

گرایش: میکروبیولوژی

 

عنوان:

کلونینگ، بیان، تخلیص و بررسی فعالیت آنزیم سراپپتیداز حاصل از سراشیا مارسسنس

 

استاد راهنما:

دکتر خسرو خواجه

 

استاد مشاور:

دکتر صادق حسن نیا

تابستان 1392

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                          شماره صفحه

چکیده

فصل اول : کلیات

1-1مقدمه…………… 2

1-2 بیان مسئله، اهمیت و ضرورت تحقیق…….5

1-2-1 آنزیم ها 5

1-2-2 غربالگري screeningآنزيم ها واهميت آن. 6

1-2-3 منابع آنزيمي.. 7

1-2-3-1 ميکروارگانيزم ها به عنوان عمده ترين منابع آنزيمي.. 7

1-2-3-2 موقعيت تاکسونوميک توليد کننده هاي شناخته شده آنزيمي.. 8

1-2-3-3 ميکروارگانيسم هايGRAS.. 8

1-2-4 کلکسيونهاي ميکروب (Culture Collection)به عنوان منابع ميکروارگانيسم ها 9

1-2- 5 بازار جهانی آنزیم. 10

1-2-6 پروتئازها 11

1-2-6-1 اعمال پروتئازها. 12

1-2-6-2 دسته بندی پروتئازها. 17

1-2-7 کاربرد پروتئازها 22

1-2-7-1 صنعت شوینده. 22

1-2-7-2 صنعت چرم. 23

1-2-7-3 صنایع دارویی.. 24

1-2-7-4 صنایع غذایی.. 25

1-2-8 سراشیا مارسسنس… 26

1-2- 9 سراشیاپپتیداز و اهمیت آن. 28

1-2-10 روشهاي DNA نوترکيب و اهميت آن. 29

1-2-11 انتخاب ميزبان بيان ژن. 30

1-2- 12راهبردهاي نسخه برداري (انتخاب حاملين بيان ژن) 31

1-2-13 سيستم بيانpET.. 32

1-2-14استراتژي خالص سازي محصول نوترکيب.. 34

هدف از انجام پروژه 36

فصل دوم: پیشینه پژوهش

2-1 ادبیات و سوابق مربوطه…39

فصل سوم: روش شناسی

3-1مواد شيميايي.. 42

3-2 ميكروارگانيسم ها ومحيط هاي كشت مورد استفاده 43

3-2-1 ميكروارگانيسم ها و پلاسميدها. 43

3-2-2محيط هاي كشت ميكروبي.. 44

3-3 روش سنجش فعالیت پروتئاز. 45

3-4 مطالعات اولیه آنزیم شناسي.. 46

3-4-1 اثر دما بر پايداري آنزيم.. 46

3-4-2 اثر pH بر پایداری آنزیم.. 46

3-4-3 دماي بهينه. 47

3-4-4 تعيين پارامترهاي سينتيكي آنزيم.. 47

3-5 جداسازي باکتري.. 48

3-5-1 استخراج  DNAژنومي.. 48

3-5-2 طراحی پرايمر و انجام PCR… 48

 3-5-2-1 مراحل PCR ………..49

3-5-3 کلون سازی ژن سراپپتیداز در وکتورT/A  . 50

3-5-4 رسم درخت فیلوژنتیک…. 51

3-5-5 تعیین توالی ژن کدکننده سراپپتیداز. 51

3-6 روشهای الکتروفورزی.. 53

3-6-1 SDS-PAGE.. 53

3-6-2 الکتروفورز ژل آگارز(100). 53

3-7 فنون مربوط به DNA نوتركيب.. 54

3-7-1 ساختار ناقل كلونينگ…. 54

3-7-2 آماده سازي قطعهDNA  براي انتقال به درون وكتور. 55

3-7-3 استخراج DNA از روي ژل.. 56

3-7- 4 مراحل کلون مجدد. 56

3-7-5 مستعدکردن باکتري  DH5αبه روش استفاده از محلول CaCl2 (M 1/0). 58

3-7-6 انتقال محصول الحاق به درون باکتري مستعدDH5α . 59

3-8 بافرCracking. 60

3- 9بيان ژن سراپپتیداز و تعيين خلوص آن توسطSDS-PAGE 62

3-9-1 القاء باکتري و بيان پروتئين هاي نوترکيب… 62

3-9-2 بررسي بيان پروتئين هاي نوترکيب با استفاده از روش الکتروفورز. 63

3-10 تخليص پروتئين هاي نوترکيب.. 66

3-10-1 بافرهاي موردنياز تخليص پروتئين نوترکيب… 66

3-10-2 روش تخليص پروتئين نوترکيب… 67

فصل چهارم: تجزیه وتحلیل داده ها

4-1 جداسازي باکتري.. 70

4-2 استخراج  DNAژنومي.. 70

4-3 رسم درخت فیلوژنتیکی.. 70

4-4 کلون کردن ژن سراپپتیداز در حامل بيانيpET28-a (+) 71

4-5 بيان و تخليص ژن سراپپتیداز نوترکيب.. 75

4-6 منحني استاندارد. 77

4-7  اثر pH روي فعاليت آنزيم. 77

4-8 دماي بهينه آنزيم. 78

4 -9 بررسی خصوصویات کاتالیتیک آنزیم……79

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1 نتیجه گیری نهایی.. 88

5-2 پیشنهادات.. 88

 منابع و مأخذ. 89

فهرست منابع انگلیسی….89

فهرست جداول

عنوان                                                                                                          شماره صفحه

جدول 3-1 خصوصیات انواع سویه ها و پلاسمیدهای مورد استفاده در پژوهش …………………………………43

جدول 3-2 نسبت های واکنش الحاق …………………………………………………………………………………………..57

فهرست اشکال

عنوان                                                                                                          شماره صفحه

شکل 1-1 سیستم بیان pET ……………………………………………………………………………………………………….34

شکل 2-1 ناقل کلونینگPet28a…………………………………………………………………………………………………55

شکل 4-1 درخت فیلوژنتیکی رسم شده با استفاده از NCBI…………………………………………………………..71

شکل 4-2 الکتروفورز محصول واکنش PCR…………………………………………………………………………………72

شکل 4-3 الکتروفورز پلاسميد هاي استخراج شده از باکتریهای ترانسفورم شده توسط روش Cracking………………………………………………………………………………………………………………………………..73

شکل 4-4 نمونه های پلاسمیدی حاوی ژن…………………………………………………………………………………….74

شکل 4-5 محصول واکنش PCR…………………………………………………………………………………………………75

شکل 4-6 ژل الکتروفورز آنزیم تخلیص شده ………………………………………………………………………………..76

فهرست نمودارها

عنوان                                                                                                          شماره صفحه

نمودار 4-7 منحنی استاندارد غلظت تیروزین …………………………………………………………………………………77

نمودار 4-8 تأثیر pH بر روی فعالیت سراپپتیداز …………………………………………………………………………….78

نمودار 4-9 اثر دما بر روی فعالیت سراپپتیداز ………………………………………………………………………………..79

نمودار 4-10 منحنی میکائیلیس-منتن از فعالیت پروتئازی ……………………………………………………………….80

فصل اول

کلیات

مقدمه

پروتئازها از مهم ترین آنزیم های صنعتی هستند که حداقل یک چهارم تولیدات آنزیمی در سطح جهان را به خود اختصاص داده اند و بطور گسترده در صنایع مختلف از جمله موادغذایی، موادشوینده، داروسازی، چرمسازی و… مورد استفاده قرار می گیرند (Ghaemi et al, 2005). از جمله موارد حائزاهمیت کمبود این آنزیم، قليايي شدن بيش از حد خون مي باشد بطوريكه قلیایی شدن این محیط باعث اضطراب و بی خوابی می شود وهم چنین کمبود آن سبب ورم مفاصل و پوکی استخوان ودیگر بیماری های کمبود کلسیم می شود. از آنجایی که پروتئین تبدیل به گلوکز می شود و هضم پروتئین ناکافی منجر به هیپو گلیسمی می شود. با توجه به مطالب فوق از میان پروتئازهای میکروبی، سراشیا مارسسنس پروتئاز خارج سلولی قوی به نام سراپپتیداز تولید می کند و پزشکان در سراسر اروپا و آسیا مزایای ضد التهابی و ضد درد این ماده را به رسمیت شناخته اند و از آن به عنوان جایگزین سالیسیلات ها، ایبوپروفن و سایر داروهای ضد درد غیراستروئیدی در درمان استفاده می شود ( Mazzone ,1990).

 

منابع توليد آنزيمها بسيار متنوع است. بطوریکه از صد ها آنزیمی که بطور تجاری استفاده می شود بیش از نیمی از آنها از قارچ و مخمر و بیش از یک سوم آنها از باکتری ها و باقی مانده از گیاهان و حیوانات حاصل می شود. بنا به دلايل زير ميکروبها به عنوان منابع آنزيمي نسبت به گياهان و جانوران ترجيح داده مي شوند:1- عموما توليد آنها ارزانتر است  2- آنزيمهاي حاصل از آنها  قابل پيش بيني و قابل کنترل تر هستند، 3- بافتهاي گياهي و جانوري نسبت به میکروارگانیسم ها مواد مضر بيشتري دارند (مانند ترکيبات فنلي در گياهان، مهارکننده هاي داخل سلولي و پروتئازها)، 4- نسبت به گياهان و جانوران راحت تر مي توان ميکروب ها را از نظر ژنتيکي دستکاري نمود، 5- ميکروارگانيزم ها را مي توان در مقادير بالا و در يک مدت زمان نسبتا کم از طريق روشهاي تخمير کشت داد 6- پروتئين هاي ميکروبي اغلب نسبت به همتاهاي جانوري و گياهي خود پايدارترند. 7-منابع قابل اعتمادی از مواد اولیه جهت رشد آنها به راحتی فراهم میشود. بطور کلی می توان گفت محدودیت تولید آنزیم های حیوانی و گیاهی از یک سو و تولید ناکافی این منابع برای پاسخ به در خواست جهانی تولید آنزیم و توجه را به سوی آنزیم های میکروبی معطوف کرده است (Kroner, 1984).

امروزه آنزیم ها در صنایع مختلف کاربردهای فراوانی دارند بطوریکه در سال ۲۰۰۰ بازاری معادل ۱.۵ بیلیون دلار آمریکا صرف خرید آنزیم برای استفاده در صنایع گوناگون شده است.  از میان آنزیم ها آنزیم هایی که نقش هیدرولیز کننده دارند مانند پروتئازها، آمیلاز، استراز و لیپازها حائز بیشترین اهمیت می باشد. در این میان ۴۰٪ از سهم فروش سالیانه آنزیمی (معادل ۱۳۰۰-۱۵۰۰تن در سال) مربوط به پروتئازها می باشد. پروتئازها در صنایع گوناگون کاربرد دارند. بخش عمده ای از کاربرد آنها در شوینده ها به عنوان افزودنی و مابقی در صنایع غذایی، دارویی، چرم و تشخیص پزشکی استفاده می شود (Gupta, 2004). از میان پروتئازهای میکروبی، سراشیا مارسسنس پروتئاز خارج سلولی قوی به نام سراپپتیداز تولید می کند که این آنزیم هم چنین با نام های سرالیزین و سراشیاپپتاز و سراشیو پپتیداز شناخته می شود. سراپپتیداز متالوپروتئاز حاوی روی خارج سلولی و شامل ۴۷۰ اسید آمینه و با جرم مولکولی63250 دالتون می باشد که توسط انتروباکتریوم سراشیا غیر پاتوژن E15 تولید می شود. این میکروارگانیسم در ابتدا در اواخر ۱۹6۰ از روده کرم ابریشم جدا شد (Hase& Finkelstein , 1993).

این آنزیم به دلیل توانایی آن در درمان انسداد شریانی در بیماران مبتلا به بیماری عروق کرونر به عنوان آنزیم معجزه توصیف می شود (Raskin, 1999). سراپپتیداز دارای خواص ضد التهابی قوی و در درمان تورم پس از ضربه و بیماری های پستان فیبروسیس و برونشیت بسیار مفید است. کاهش درد از دیگر ویژگی های آن است که علت آن توانایی در جلوگیری از آزاد شدن آمین ها یا القاکننده درد از بافتهای ملتهب است (Mazzonie  et al, 1990). بنابراین با توجه به مزایای فوق میتوان ازآن به عنوان یک آنزیم دارویی استفاده کرد.

تعداد صفحه : 116

قیمت : 14700تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        ———-        [email protected]

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

***  *** ***